用于鉴定抗体依赖性细胞毒性修饰化合物的高内涵筛选检测

该协议提供了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下鉴定调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤的化合物。

使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫疗法彻底改变了乳腺癌的治疗。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可以被抗HER-2抗体曲妥珠单抗靶向。抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可以被ADCC效应细胞（例如自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞）的Fc受体识别，触发这些免疫细胞的细胞毒性活性，导致癌细胞死亡。我们着手开发一种用于定量ADCC的基于图像的检测方法，以通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节剂化合物。在该测定中，HER2过表达JIMT-1乳腺癌细胞在曲妥珠单抗存在下与NK-92细胞共培养，并通过自动显微镜和定量图像分析量化靶细胞死亡。根据其EGFP荧光将靶细胞与效应细胞区分开来。我们展示了如何在测定中测试化合物库以鉴定ADCC调节剂药物。为此，使用实验室货架上随机选择的精细化学品建立了一个化合物库测试板。测试库中还包括三种有望干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管不稳定化合物（秋水仙碱，长春新碱，鬼臼毒素）。测试筛选将所有三种阳性对照化合物鉴定为命中，证明该方法适用于鉴定化学库中的ADCC修饰药物。通过该测定，可以进行化合物库筛选以鉴定ADCC增强化合物，这些化合物可用作治疗接受抗癌免疫治疗的患者的辅助治疗剂。此外，该方法还可用于鉴定癌症患者针对不同适应症服用的治疗药物的任何不良ADCC抑制副作用。

使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体表达 T （CAR-T） 细胞进行免疫治疗是癌症治疗的有力方法¹，^2，3。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗HER-2（人表皮生长因子受体2）抗体，用于治疗HER-2阳性早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性转移性胃癌⁴，^5，6。它主要通过抑制表皮生长因子⁴的增殖刺激作用起作用。然而，据报道，曲妥珠单抗有效地触发癌细胞死亡，即使癌细胞已经失去了对 HER-2 刺激的反应性⁷。抗体的这种矛盾效应是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）⁷。ADCC 可由自然杀伤 （NK） 细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，统称为 ADCC^8，9 的效应细胞。如果抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合，则这些效应细胞使用其Fc受体结合抗体的恒定（Fc）区域。抗体桥接肿瘤细胞和携带Fc受体的效....

注意：检测工作流程的关键步骤如图 2所示。

图 2：ADCC 屏幕的工作流程。 接种到96孔HCS板中的JIMT-1-EGFP靶细胞用化合物库的药物处理。反过来，加入未染色的NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，并在0时间点和孵育3小时后对板进?.......

为了演示该测定在现实生活中的工作原理，我们创建了一个测试库，其中包含从实验室货架中随机选择的16种化合物（图3）。此外，DMSO也作为阴性对照，三种微管聚合抑制剂化合物（秋水仙碱，长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后者有望通过干扰NK细胞向癌细胞的迁移和NK细胞脱颗粒来抑制ADCC。将所有测试化合物和DMSO一式四份放置在测试文库板上，并将DMSO也添加到板?.......

ADCC反应在很久以前就已经描述过了。该过程的关键分子事件也已描述¹⁹。测量ADCC的方法范围从金标准放射性铬释放测定，细胞质酶释放测定到几种基于荧光的流式细胞术或微孔板测定²⁰。然而，这些测定的一个常见局限性是它们不适合高通量应用。此前，我们开发了一种基于图像的HCS测定法，适用于筛选ADCC修饰药物的化合物库¹⁸。然而，先前?.......

LV获得了国家研究，发展和创新办公室赠款GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS“，GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE和OTKA K132193，K147482的资助。CD16.176V.NK-92细胞来自Kerry S. Campbell博士（宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯中心，代表Brink Biologics，lnc。加利福尼亚州圣地亚哥），受全球专利保护，并由Nantkwest，lnc授权。作者感谢György Vereb和Árpád Szöőr在使用NK-92细胞系方面的帮助和技术建议。