Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Denne protokol præsenterer en automatiseret, billedbaseret high-throughput teknik til at identificere forbindelser, der modulerer naturligt dræbercellemedieret brystkræftcelledrab i nærvær af et terapeutisk anti-HER-2-antistof.
Immunterapi med antigenspecifikke antistoffer eller immuncheckpoint-hæmmere har revolutioneret behandlingen af brystkræft. Brystkræftceller, der udtrykker den epidermale vækstfaktorreceptor HER2, kan målrettes af anti-HER-2-antistoffet trastuzumab. Antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) er en vigtig mekanisme, der er impliceret i antitumorvirkningen af HER-2. Trastuzumab bundet til kræftceller kan genkendes af Fc-receptorerne i ADCC-effektorceller (f.eks. naturlige dræberceller (NK), makrofager og granulocytter), hvilket udløser disse immuncellers cytotoksiske aktivitet, der fører til kræftcelledød. Vi satte os for at udvikle et billedbaseret assay til kvantificering af ADCC for at identificere nye ADCC-modulatorforbindelser ved screening med højt indhold. I analysen dyrkes HER2-overekspression af JIMT-1 brystkræftceller sammen med NK-92-celler i nærvær af trastuzumab, og målcelledød kvantificeres ved automatiseret mikroskopi og kvantitativ billedanalyse. Målceller skelnes fra effektorceller baseret på deres EGFP-fluorescens. Vi viser, hvordan sammensatte biblioteker kan testes i analysen for at identificere ADCC-modulatorlægemidler. Til dette formål blev en sammensat bibliotekstestplade oprettet ved hjælp af tilfældigt udvalgte fine kemikalier fra laboratoriehylden. Tre mikrotubulusdestabiliserende forbindelser (colchicin, vincristin, podophyllotoxin), der forventes at interferere med NK-cellemigration og degranulering, blev også inkluderet i testbiblioteket. Testskærmen identificerede alle tre positive kontrolforbindelser som hits, der beviser metodens egnethed til at identificere ADCC-modificerende lægemidler i et kemisk bibliotek. Med dette assay kan sammensatte biblioteksskærme udføres for at identificere ADCC-forstærkende forbindelser, der kan anvendes som adjuverende terapeutiske midler til behandling af patienter, der modtager anticancerimmunterapier. Derudover kan metoden også bruges til at identificere eventuelle uønskede ADCC-hæmmende bivirkninger af terapeutiske lægemidler taget af kræftpatienter til forskellige indikationer.
Immunterapi med anticancerantistoffer, immuncheckpointhæmmere eller kimære antigenreceptorekspressive T (CAR-T) celler repræsenterer en kraftfuld tilgang til kræftbehandling 1,2,3. Trastuzumab er et humaniseret monoklonalt anti-HER-2 (humant epidermal vækstfaktorreceptor 2) antistof, der anvendes til behandling af HER-2-positiv brystkræft i et tidligt stadium eller metastatisk brystkræft, samt HER-2-positiv metastatisk gastrisk cancer 4,5,6. Det virker primært ved at hæmme den prolif....
BEMÆRK: De vigtigste trin i analysearbejdsgangen er vist i figur 2.
Figur 2: Arbejdsforløb på ADCC-skærmen. JIMT-1-EGFP målceller podet i 96 brønd HCS-plader behandles med lægemidler fra det sammensatte bibliotek. Til gengæld tilsættes ufarvede NK (effektor) celler og trastuzumab, og.......
For at demonstrere, hvordan analysen fungerer i det virkelige liv, oprettede vi et testbibliotek med 16 forbindelser udvalgt tilfældigt fra laboratoriehylderne (figur 3). Derudover blev DMSO også inkluderet som en negativ kontrol og tre mikrotubuluspolymerisationshæmmere (colchicin, vincristin og podophyllotoxin) som positive kontroller. Sidstnævnte forventedes at hæmme ADCC ved at forstyrre NK-cellemigration til kræftcellerne og NK-celledegranulering. Alle teststoffer og DMSO blev anb.......
ADCC-reaktionen er blevet beskrevet for relativt længe siden. Vigtige molekylære begivenheder i processen er også blevet beskrevet19. Metoder til måling af ADCC spænder fra guldstandarden radioaktiv kromfrigivelsesanalyse, cytoplasmatisk enzymfrigivelsesassays til flere fluorescensbaserede flowcytometri- eller mikropladeassays20. En almindelig begrænsning ved disse analyser er imidlertid, at de ikke er modtagelige for applikationer med høj kapacitet. Tidligere udvikl.......
LV modtog støtte fra National Research, Development and Innovation Office bevillinger GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE og OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler blev opnået fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på vegne af Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet af patenter over hele verden og blev licenseret af Nantkwest, lnc. Forfatterne er taknemmelige for György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjælp med brugen af NK-92-cellelinjen og for teknisk rådgivning.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
Harmony software | PerkinElmer | ||
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved