High-Content screening assay voor de identificatie van antilichaam-afhankelijke cellulaire cytotoxiciteit modificerende verbindingen

Dit protocol presenteert een geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde high-throughput-techniek om verbindingen te identificeren die natural killer cel-gemedieerde borstkankerceldoding moduleren in de aanwezigheid van een therapeutisch anti-HER-2-antilichaam.

Immunotherapie met antigeenspecifieke antilichamen of immuuncheckpointremmers heeft een revolutie teweeggebracht in de therapie van borstkanker. Borstkankercellen die de epidermale groeifactorreceptor HER2 tot expressie brengen, kunnen het doelwit zijn van het anti-HER-2-antilichaam trastuzumab. Antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) is een belangrijk mechanisme dat betrokken is bij de antitumorwerking van HER-2. Trastuzumab gebonden aan kankercellen kan worden herkend door de Fc-receptoren van ADCC-effectorcellen (bijv. Natural killer (NK) cellen, macrofagen en granulocyten), waardoor de cytotoxische activiteit van deze immuuncellen wordt geactiveerd die leidt tot kankerceldood. We wilden een op afbeeldingen gebaseerde test ontwikkelen voor de kwantificering van ADCC om nieuwe ADCC-modulatorverbindingen te identificeren door middel van screening met een hoog gehalte. In de test worden HER2-overexpressie van JIMT-1-borstkankercellen samen gekweekt met NK-92-cellen in aanwezigheid van trastuzumab en wordt de dood van doelcellen gekwantificeerd door geautomatiseerde microscopie en kwantitatieve beeldanalyse. Doelcellen worden onderscheiden van effectorcellen op basis van hun EGFP-fluorescentie. We laten zien hoe samengestelde bibliotheken kunnen worden getest in de test om ADCC-modulatorgeneesmiddelen te identificeren. Voor dit doel werd een samengestelde bibliotheektestplaat opgezet met behulp van willekeurig geselecteerde fijne chemicaliën van de laboratoriumplank. Drie microtubuli destabiliserende verbindingen (colchicine, vincristine, podofyllotoxine) waarvan verwacht wordt dat ze de NK-celmigratie en degranulatie verstoren, werden ook opgenomen in de testbibliotheek. Het testscherm identificeerde alle drie de positieve controleverbindingen als treffers die de geschiktheid van de methode bewijzen om ADCC-modificerende geneesmiddelen in een chemische bibliotheek te identificeren. Met deze test kunnen samengestelde bibliotheekschermen worden uitgevoerd om ADCC-verbeterende verbindingen te identificeren die kunnen worden gebruikt als adjuvante therapeutische middelen voor de behandeling van patiënten die immunotherapieën tegen kanker krijgen. Bovendien kan de methode ook worden gebruikt om ongewenste ADCC-remmende bijwerkingen van therapeutische geneesmiddelen die door kankerpatiënten voor verschillende indicaties worden ingenomen, te identificeren.

Immunotherapie met antikankerantistoffen, immuuncheckpointremmers of chimere antigeenreceptor-expressie T (CAR-T) cellen vertegenwoordigt een krachtige benadering van kankerbehandeling ^1,2,3. Trastuzumab is een gehumaniseerd monoklonaal anti-HER-2 (humane epidermale groeifactorreceptor 2) antilichaam dat wordt gebruikt voor de behandeling van HER-2-positieve vroege stadium of gemetastaseerde borstkanker, evenals HER-2-positieve gemetastaseerde maagkanker ^4,5,6. Het werkt voornamelijk....

OPMERKING: De belangrijkste stappen van de testworkflow worden weergegeven in figuur 2.

Figuur 2: Workflow van het ADCC-scherm. JIMT-1-EGFP-doelcellen gezaaid in 96 put HCS-platen worden behandeld met geneesmiddelen van de samengestelde bibliotheek. Op hun beurt worden ongekleurde NK (effecto.......

Om te laten zien hoe de test in het echte leven werkt, hebben we een testbibliotheek gemaakt van 16 willekeurig geselecteerde verbindingen uit de laboratoriumschappen (figuur 3). Daarnaast werd DMSO ook opgenomen als een negatieve controle, en drie microtubule polymerisatieremmers (colchicine, vincristine en podofyllotoxine) als positieve controles. Van deze laatste werd verwacht dat ze ADCC zouden remmen door te interfereren met NK-celmigratie naar de kankercellen en NK-celdegranulatie. All.......

De ADCC-reactie is relatief lang geleden beschreven. Belangrijke moleculaire gebeurtenissen van het proces zijn ook beschreven¹⁹. Methoden voor het meten van ADCC variëren van de gouden standaard radioactieve chroom release assay, cytoplasmatische enzym release assays tot verschillende fluorescentie-gebaseerde flowcytometrie of microplate assays²⁰. Een veel voorkomende beperking van deze testen is echter dat ze niet vatbaar zijn voor toepassingen met een hoge doorvoer. Eer.......

LV ontving financiering van de subsidies van het National Research, Development and Innovation Office GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE en OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 cellen werden verkregen van Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, namens Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), worden wereldwijd beschermd door patenten en werden in licentie gegeven door Nantkwest, lnc. De auteurs zijn György Vereb en Árpád Szöőr dankbaar voor hun hulp bij het gebruik van de NK-92 cellijn en voor technisch advies.