Essai de criblage à haute teneur pour l’identification de composés modificateurs de la cytotoxicité cellulaire dépendants des anticorps

Ce protocole présente une technique automatisée à haut débit basée sur l’image pour identifier les composés modulant la destruction des cellules cancéreuses du sein médiée par les cellules tueuses naturelles en présence d’un anticorps thérapeutique anti-HER-2.

L’immunothérapie avec des anticorps spécifiques de l’antigène ou des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire a révolutionné le traitement du cancer du sein. Les cellules cancéreuses du sein exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique HER2 peuvent être ciblées par l’anticorps anti-HER-2 trastuzumab. La cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) est un mécanisme important impliqué dans l’action antitumorale de HER-2. Le trastuzumab lié aux cellules cancéreuses peut être reconnu par les récepteurs Fc des cellules effectrices ADCC (p. ex. cellules tueuses naturelles (NK), macrophages et granulocytes), déclenchant l’activité cytotoxique de ces cellules immunitaires conduisant à la mort des cellules cancéreuses. Nous avons entrepris de développer un test basé sur l’image pour la quantification de l’ADCC afin d’identifier de nouveaux composés modulateurs de l’ADCC par criblage à haute teneur. Dans le test, les cellules cancéreuses du sein JIMT-1 surexprimant HER2 sont co-cultivées avec des cellules NK-92 en présence de trastuzumab, et la mort cellulaire cible est quantifiée par microscopie automatisée et analyse quantitative d’images. Les cellules cibles sont distinguées des cellules effectrices en fonction de leur fluorescence EGFP. Nous montrons comment les banques de composés peuvent être testées dans le test pour identifier les médicaments modulateurs de l’ADCC. À cette fin, une plaque d’essai de bibliothèque de composés a été mise en place en utilisant des produits chimiques fins sélectionnés au hasard sur les étagères du laboratoire. Trois composés déstabilisants des microtubules (colchicine, vincristine, podophyllotoxine) susceptibles d’interférer avec la migration et la dégranulation des cellules NK ont également été inclus dans la bibliothèque de tests. Le criblage d’essai a identifié les trois composés témoins positifs comme des résultats prouvant la pertinence de la méthode pour identifier les médicaments modifiant l’ADCC dans une bibliothèque chimique. Avec ce test, des criblages de bibliothèques de composés peuvent être effectués pour identifier les composés améliorant l’ADCC qui pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques adjuvants pour le traitement des patients recevant des immunothérapies anticancéreuses. En outre, la méthode peut également être utilisée pour identifier les effets secondaires indésirables inhibiteurs de l’ADCC des médicaments thérapeutiques pris par les patients cancéreux pour différentes indications.

L’immunothérapie avec des anticorps anticancéreux, des inhibiteurs du point de contrôle immunitaire ou des lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR-T) représente une approche puissante du traitement du cancer ^1,2,3. Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé anti-HER-2 (récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain) utilisé pour traiter le cancer du sein à un stade précoce ou métastatique HER-2 positif, ainsi que le cancer gastrique métastatique HER-2 positif ^4,5,6

REMARQUE : Les étapes clés du flux de travail de l’essai sont présentées à la figure 2.

Figure 2 : Workflow de l’écran ADCC. Les cellules cibles JIMT-1-EGFP ensemencées dans des plaques HCS à 96 puits sont traitées avec des médicaments de la bibliothèque de composés. À leur t.......

Pour démontrer comment le test fonctionne dans la vie réelle, nous avons créé une bibliothèque de tests de 16 composés sélectionnés au hasard dans les étagères du laboratoire (Figure 3). En outre, le DMSO a également été inclus comme témoin négatif, et trois composés inhibiteurs de polymérisation des microtubules (colchicine, vincristine et podophyllotoxine) comme témoins positifs. Ces derniers devaient inhiber l’ADCC en interférant avec la migration des cellules NK vers.......

La réaction de l’ADCC a été décrite il y a relativement longtemps. Les événements moléculaires clés du processus ont également été décrits¹⁹. Les méthodes de mesure de l’ADCC vont du test de libération de chrome radioactif de référence, des tests de libération d’enzymes cytoplasmiques à plusieurs tests de cytométrie en flux ou de microplaques basés sur la fluorescence²⁰. Cependant, une limitation commune de ces tests est qu’ils ne se prêtent pas.......

LV a reçu un financement de l’Office national de la recherche, du développement et de l’innovation subventions GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS », GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE et OTKA K132193, K147482. Les cellules CD16.176V.NK-92 ont été obtenues du Dr Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, pour le compte de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sont protégés par des brevets dans le monde entier et ont été concédés sous licence par Nantkwest, lnc. Les auteurs remercient György Vereb et Árpád Szöőr pour leur aide dans l’utilisation de la lignée cellulaire NK-92 et pour leurs conseils techniques.