High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

Die Immuntherapie mit antigenspezifischen Antikörpern oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren hat die Therapie von Brustkrebs revolutioniert. Brustkrebszellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 exprimieren, können mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab angegriffen werden. Die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ist ein wichtiger Mechanismus, der an der Antitumorwirkung von HER2 beteiligt ist. Trastuzumab, das an Krebszellen gebunden ist, kann von den Fc-Rezeptoren von ADCC-Effektorzellen (z. B. natürlichen Killerzellen, Makrophagen und Granulozyten) erkannt werden, wodurch die zytotoxische Aktivität dieser Immunzellen ausgelöst wird, die zum Tod von Krebszellen führt. Wir haben uns zum Ziel gesetzt, einen bildbasierten Assay für die Quantifizierung von ADCC zu entwickeln, um neuartige ADCC-Modulatorverbindungen durch High-Content-Screening zu identifizieren. In dem Assay werden HER2-überexprimierende JIMT-1-Brustkrebszellen mit NK-92-Zellen in Gegenwart von Trastuzumab kokultiviert, und der Zielzelltod wird durch automatisierte Mikroskopie und quantitative Bildanalyse quantifiziert. Zielzellen werden anhand ihrer EGFP-Fluoreszenz von Effektorzellen unterschieden. Wir zeigen, wie Substanzbibliotheken im Assay getestet werden können, um ADCC-Modulatoren zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Compound-Library-Testplatte mit zufällig ausgewählten Feinchemikalien aus dem Laborregal aufgebaut. Drei Mikrotubuli-destabilisierende Verbindungen (Colchicin, Vincristin, Podophyllotoxin), von denen angenommen wird, dass sie die Migration und Degranulation von NK-Zellen stören, wurden ebenfalls in die Testbibliothek aufgenommen. Das Testscreening identifizierte alle drei Positivkontrollverbindungen als Treffer, was die Eignung der Methode zur Identifizierung von ADCC-modifizierenden Medikamenten in einer chemischen Bibliothek belegt. Mit diesem Assay können Substanzbibliotheks-Screenings durchgeführt werden, um ADCC-verstärkende Verbindungen zu identifizieren, die als adjuvante Therapeutika für die Behandlung von Patienten verwendet werden könnten, die Krebsimmuntherapien erhalten. Darüber hinaus können mit der Methode auch unerwünschte ADCC-hemmende Nebenwirkungen von Therapeutika identifiziert werden, die von Krebspatienten für verschiedene Indikationen eingenommen werden.

Die Immuntherapie mit Antikrebsantikörpern, Immun-Checkpoint-Inhibitoren oder chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T (CAR-T)-Zellen stellt einen wirksamen Ansatz zur Krebsbehandlung dar ^1,2,3. Trastuzumab ist ein humanisierter monoklonaler Anti-HER2-Antikörper (humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2), der zur Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs im Frühstadium oder metastasierendem Brustkrebs sowie HER2-positivem metastasierendem Magenkrebs eingesetzt wird ^4,5,6. Es wi....

HINWEIS: Die wichtigsten Schritte des Assay-Workflows sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Workflow des ADCC-Bildschirms. JIMT-1-EGFP-Zielzellen, die in 96 Well-HCS-Platten ausgesät wurden, werden mit Medikamenten aus der Substanzbibliothek behandelt. Im Gegenzug werden ungefärbte .......

Um zu demonstrieren, wie der Assay in der Praxis funktioniert, haben wir eine Testbibliothek mit 16 Verbindungen erstellt, die nach dem Zufallsprinzip aus den Laborregalen ausgewählt wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus wurde DMSO als Negativkontrolle und drei Mikrotubuli-Polymerisationshemmerverbindungen (Colchicin, Vincristin und Podophyllotoxin) als Positivkontrollen eingeschlossen. Letztere sollten ADCC hemmen, indem sie die Migration von NK-Zellen zu den Krebszellen und die Degranulat.......

Die ADCC-Reaktion wurde schon vor relativ langer Zeit beschrieben. Wichtige molekulare Ereignisse des Prozesses wurden ebenfalls beschrieben¹⁹. Die Methoden zur Messung der ADCC reichen vom Goldstandard für den Assay zur Freisetzung von radioaktivem Chrom über zytoplasmatische Enzymfreisetzungsassays bis hin zu verschiedenen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie- oder Mikrotiterplatten-Assays²⁰. Eine häufige Einschränkung dieser Assays besteht jedoch darin, dass sie.......

LV erhielt Mittel aus den Zuschüssen des Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsamtes GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE und OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92-Zellen wurden von Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, im Auftrag von Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sind weltweit durch Patente geschützt und wurden von Nantkwest, lnc, lizenziert. Die Autoren danken György Vereb und Árpád Szöőr für ihre Hilfe bei der Verwendung der NK-92-Zelllinie und für die technische Beratung.