Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.
אימונותרפיה עם נוגדנים ספציפיים לאנטיגן או מעכבי בקרה חיסונית חוללה מהפכה בטיפול בסרטן השד. תאי סרטן השד המבטאים את קולטן גורם הגדילה האפידרמיס HER2 יכולים להיות ממוקדים על ידי נוגדן נגד HER-2 trastuzumab. ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) היא מנגנון חשוב המעורב בפעילות האנטי-סרטנית של HER-2. Trastuzumab הקשורים לתאים סרטניים יכול להיות מזוהה על ידי קולטני Fc של תאים משפיעים ADCC (למשל, תאי הרג טבעי (NK), מקרופאגים, גרנולוציטים), הפעלת הפעילות ציטוטוקסית של תאים חיסוניים אלה המוביל למוות תאים סרטניים. יצאנו לפתח בדיקה מבוססת תמונה לכימות ADCC כדי לזהות תרכובות אפנן ADCC חדשות על ידי סינון תוכן גבוה. בניסוי, תאי סרטן השד JIMT-1 בעלי ביטוי יתר של HER2 מתורבתים יחד עם תאי NK-92 בנוכחות טרסטוזומאב, ומוות תאי המטרה מכומת על ידי מיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה כמותי. תאי המטרה נבדלים מתאי אפקט בהתבסס על פלואורסצנטיות ה-EGFP שלהם. אנו מראים כיצד ניתן לבדוק ספריות מורכבות בבדיקה כדי לזהות תרופות אפנן ADCC. לשם כך הוצבה פלטת בדיקה של ספריית תרכובת באמצעות כימיקלים עדינים שנבחרו באופן אקראי ממדף המעבדה. שלוש תרכובות מערערות יציבות מיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין, פודופילוטוקסין) הצפויות להפריע לנדידת תאי NK ולפירוק תאי NK נכללו גם הן בספריית הבדיקה. מסך הבדיקה זיהה את כל שלוש תרכובות הבקרה החיוביות כפגיעות המוכיחות את התאמת השיטה לזיהוי תרופות משנות ADCC בספרייה כימית. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבצע מסכי ספרייה מורכבים כדי לזהות תרכובות משפרות ADCC שיכולות לשמש כסוכני טיפול אדג'ובנטיים לטיפול בחולים המקבלים אימונותרפיה אנטי-סרטנית. בנוסף, השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי תופעות לוואי בלתי רצויות מעכבות ADCC של תרופות טיפוליות הנלקחות על ידי חולי סרטן עבור אינדיקציות שונות.
אימונותרפיה עם נוגדנים אנטי-סרטניים, מעכבי בקרה חיסונית, או תאי T (CAR-T) המבטאים קולטן אנטיגן כימרי מייצגת גישה רבת עוצמה לטיפול בסרטן 1,2,3. Trastuzumab הוא נוגדן חד שבטי אנושי anti-HER-2 (קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2) המשמש לטיפול בסרטן שד חיובי HER-2 בשלב מוקדם או גרורתי, כמו גם סרטן קיבה גרורתי חיובי HER-2 4,5,6. זה פועל בעיקר על ידי עיכוב ההשפעה מגרה התפשטות של גורם גדילה אפידרמיס4. עם זאת, דווח כי trastuzumab גורם ביעילות למוות של תאים סרטניים גם א....
כדי להדגים כיצד הבדיקה פועלת בחיים האמיתיים, יצרנו ספריית בדיקות של 16 תרכובות שנבחרו באופן אקראי ממדפי המעבדה (איור 3). בנוסף, DMSO נכלל גם כבקרה שלילית, ושלוש תרכובות מעכבות פילמור מיקרוטובול (קולכיצין, וינכריסטין ופודופילוטוקסין) כבקרות חיוביות. אלה האחרונים היו צפויים לעכ?.......
תגובת ADCC תוארה לפני זמן רב יחסית. אירועים מולקולריים מרכזיים של התהליך תוארו גם הם19. השיטות למדידת ADCC נעות בין בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי בתקן הזהב, מבחני שחרור אנזימים ציטופלזמיים למספר ציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטיות או מבחני מיקרו-לוחות20. עם זאת, מגבלה.......
LV קיבלה מימון ממענקי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ו-OTKA K132193, K147482. תאי CD16.176V.NK-92 התקבלו מד"ר קרי ס. קמפבל (מרכז פוקס צ'ייס, Philapedlphia, PA, מטעם Brink Biologics, lnc. סן דייגו, קליפורניה), מוגנים על ידי פטנטים ברחבי העולם, וקיבלו רישיון על ידי Nantkwest, lnc. המחברים מודים לגיורגי ורב ולארפד שור על עזרתם בשימוש בקו התאים NK-92 ועל הייעוץ הטכני.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
Harmony software | PerkinElmer | ||
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved