Test di screening ad alto contenuto per l'identificazione di composti modificanti la citotossicità cellulare anticorpo-dipendenti

Questo protocollo presenta una tecnica automatizzata ad alto rendimento basata su immagini per identificare i composti che modulano l'uccisione delle cellule di cancro al seno mediate da cellule natural killer in presenza di un anticorpo terapeutico anti-HER-2.

L'immunoterapia con anticorpi antigene-specifici o inibitori del checkpoint immunitario ha rivoluzionato la terapia del cancro al seno. Le cellule del cancro al seno che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico HER2 possono essere prese di mira dall'anticorpo anti-HER-2 trastuzumab. La citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) è un importante meccanismo implicato nell'azione antitumorale di HER-2. Trastuzumab legato alle cellule tumorali può essere riconosciuto dai recettori Fc delle cellule effettrici ADCC (ad esempio, cellule natural killer (NK), macrofagi e granulociti), innescando l'attività citotossica di queste cellule immunitarie che portano alla morte delle cellule tumorali. Abbiamo deciso di sviluppare un saggio basato su immagini per la quantificazione dell'ADCC per identificare nuovi composti modulatori ADCC mediante screening ad alto contenuto. Nel test, le cellule di carcinoma mammario JIMT-1 che sovraesprimono HER2 sono co-coltivate con cellule NK-92 in presenza di trastuzumab e la morte delle cellule bersaglio viene quantificata mediante microscopia automatizzata e analisi quantitativa delle immagini. Le cellule bersaglio si distinguono dalle cellule effettrici in base alla loro fluorescenza EGFP. Mostriamo come le librerie di composti possono essere testate nel test per identificare i farmaci modulatori ADCC. A tale scopo, è stata allestita una piastra di prova per librerie composte utilizzando prodotti chimici fini selezionati a caso dallo scaffale del laboratorio. Nella libreria di test sono stati inclusi anche tre composti destabilizzanti per microtubuli (colchicina, vincristina, podofillotossina) che dovrebbero interferire con la migrazione e la degranulazione delle cellule NK. Lo screening del test ha identificato tutti e tre i composti di controllo positivi come risultati che dimostrano l'idoneità del metodo per identificare i farmaci modificanti l'ADCC in una libreria chimica. Con questo test, è possibile eseguire screening della libreria di composti per identificare composti che potenziano l'ADCC che potrebbero essere utilizzati come agenti terapeutici adiuvanti per il trattamento di pazienti sottoposti a immunoterapie antitumorali. Inoltre, il metodo può anche essere utilizzato per identificare eventuali effetti collaterali indesiderati che inibiscono l'ADCC dei farmaci terapeutici assunti dai pazienti oncologici per diverse indicazioni.

L'immunoterapia con anticorpi antitumorali, inibitori del checkpoint immunitario o cellule T (CAR-T) che esprimono il recettore dell'antigene chimerico rappresenta un potente approccio al trattamento del cancro ^1,2,3. Trastuzumab è un anticorpo monoclonale umanizzato anti-HER-2 (recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano) utilizzato per il trattamento del carcinoma mammario HER-2 positivo allo stadio iniziale o metastatico, nonché del carcinoma gastrico metastatico HER-2 positivo ^4,5,6

NOTA: i passaggi chiave del flusso di lavoro del test sono presentati nella Figura 2.

Figura 2: Flusso di lavoro della schermata ADCC. Le cellule bersaglio JIMT-1-EGFP seminate in 96 piastre HCS sono trattate con farmaci della libreria composta. A loro volta, vengono aggiunte cellule NK (effe.......

Per dimostrare come funziona il test nella vita reale, abbiamo creato una libreria di test di 16 composti selezionati casualmente dagli scaffali di laboratorio (Figura 3). Inoltre, il DMSO è stato incluso anche come controllo negativo e tre composti inibitori della polimerizzazione dei microtubuli (colchicina, vincristina e podofillotossina) come controlli positivi. Ci si aspettava che questi ultimi inibissero l'ADCC interferendo con la migrazione delle cellule NK verso le cellule tumorali .......

La reazione ADCC è stata descritta relativamente molto tempo fa. Sono stati descritti anche eventi molecolari chiave del processo¹⁹. I metodi per misurare l'ADCC vanno dal saggio di rilascio di cromo radioattivo gold standard, ai saggi di rilascio di enzimi citoplasmatici a diversi test di citometria a flusso o micropiastre basati sulla fluorescenza²⁰. Tuttavia, una limitazione comune di questi test è che non sono suscettibili di applicazioni ad alta produttività. In pre.......

LV ha ricevuto finanziamenti dall'Ufficio nazionale per la ricerca, lo sviluppo e l'innovazione sovvenzioni GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE e OTKA K132193, K147482. Le cellule CD16.176V.NK-92 sono state ottenute dal Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, per conto di Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), sono protetti da brevetti in tutto il mondo e sono stati concessi in licenza da Nantkwest, lnc. Gli autori sono grati a György Vereb e Árpád Szöőr per il loro aiuto nell'uso della linea cellulare NK-92 e per i consigli tecnici.