Screeninganalyse med høyt innhold for identifisering av antistoffavhengige cellulære cytotoksisitetsmodifiserende forbindelser

Denne protokollen presenterer en automatisert, bildebasert høy gjennomstrømningsteknikk for å identifisere forbindelser som modulerer naturlig drepercellemediert brystkreftcelledreping i nærvær av et terapeutisk anti-HER-2-antistoff.

Immunterapi med antigenspesifikke antistoffer eller immunsjekkpunkthemmere har revolusjonert behandlingen av brystkreft. Brystkreftceller som uttrykker den epidermale vekstfaktorreseptoren HER2 kan målrettes av anti-HER-2 antistoffet trastuzumab. Antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) er en viktig mekanisme involvert i antitumorvirkningen av HER-2. Trastuzumab bundet til kreftceller kan gjenkjennes av Fc-reseptorene i ADCC-effektorceller (f.eks. naturlige dreperceller, makrofager og granulocytter), og utløser den cytotoksiske aktiviteten til disse immuncellene som fører til kreftcelledød. Vi satte oss fore å utvikle en bildebasert analyse for kvantifisering av ADCC for å identifisere nye ADCC-modulatorforbindelser ved screening med høyt innhold. I analysen blir HER2 overuttrykkende JIMT-1 brystkreftceller dyrket sammen med NK-92-celler i nærvær av trastuzumab, og målcelledød kvantifiseres ved automatisert mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse. Målceller skiller seg fra effektorceller basert på deres EGFP-fluorescens. Vi viser hvordan sammensatte biblioteker kan testes i analysen for å identifisere ADCC-modulatormedikamenter. For dette formålet ble en sammensatt bibliotekstestplate satt opp ved hjelp av tilfeldig utvalgte finkjemikalier fra laboratoriehyllen. Tre mikrotubuli destabiliserende forbindelser (kolkisin, vinkristin, podofyllotoksin) som forventes å forstyrre NK-cellemigrasjon og degranulering ble også inkludert i testbiblioteket. Testskjermen identifiserte alle tre positive kontrollforbindelsene som treff som viste metodens egnethet til å identifisere ADCC-modifiserende legemidler i et kjemisk bibliotek. Med denne analysen kan sammensatte biblioteksskjermer utføres for å identifisere ADCC-forsterkende forbindelser som kan brukes som adjuvante terapeutiske midler til behandling av pasienter som får immunterapi mot kreft. I tillegg kan metoden også brukes til å identifisere eventuelle uønskede ADCC-hemmende bivirkninger av terapeutiske legemidler tatt av kreftpasienter for forskjellige indikasjoner.

Immunterapi med antistoffer mot kreft, immunsjekkpunkthemmere eller kimære antigenreseptoruttrykkende T-celler (CAR-T) representerer en kraftig tilnærming til kreftbehandling ^1,2,3. Trastuzumab er et humanisert monoklonalt anti-HER-2 (humant epidermalt vekstfaktorreseptor 2) antistoff som brukes til behandling av HER-2 positiv tidlig stadium eller metastatisk brystkreft, samt HER-2 positiv metastatisk gastrisk kreft ^4,5,6. Det virker primært ved å hemme den proliferasjonsstimulerende....

MERK: De viktigste trinnene i analysearbeidsflyten er presentert i figur 2.

Figur 2: Arbeidsflyt på ADCC-skjermen. JIMT-1-EGFP målceller sådd i 96 brønn HCS-plater behandles med legemidler fra det sammensatte biblioteket. I sin tur tilsettes ufargede NK-celler (effektor) og trastuzumab, o.......

For å demonstrere hvordan analysen fungerer i det virkelige liv, opprettet vi et testbibliotek med 16 forbindelser valgt tilfeldig fra laboratoriehyllene (figur 3). I tillegg ble DMSO også inkludert som negativ kontroll, og tre mikrotubulipolymerisasjonshemmerforbindelser (kolkisin, vinkristin og podofyllotoksin) som positive kontroller. Sistnevnte ble forventet å hemme ADCC ved å forstyrre NK-cellemigrasjon til kreftcellene og NK-celledegranulering. Alle testforbindelser og DMSO ble pla.......

ADCC-reaksjonen har blitt beskrevet relativt lenge siden. Sentrale molekylære hendelser i prosessen er også beskrevet¹⁹. Metoder for måling av ADCC spenner fra gullstandarden radioaktiv kromfrigjøringsanalyse, cytoplasmatiske enzymfrigjøringsanalyser til flere fluorescensbaserte flowcytometri eller mikroplateanalyser²⁰. En vanlig begrensning av disse analysene er imidlertid at de ikke er mottagelige for applikasjoner med høy gjennomstrømning. Tidligere utviklet vi en.......

LV mottok finansiering fra National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE og OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler ble hentet fra Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på vegne av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), er beskyttet av patenter over hele verden, og ble lisensiert av Nantkwest, lnc. Forfatterne takker György Vereb og Árpád Szöőr for deres hjelp med bruken av NK-92-cellelinjen og for teknisk rådgivning.