Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.
A imunoterapia com anticorpos antígeno-específicos ou inibidores de checkpoints imunológicos revolucionou a terapia do câncer de mama. Células de câncer de mama que expressam o receptor HER2 do fator de crescimento epidérmico podem ser alvo do anticorpo anti-HER-2 trastuzumabe. A citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) é um importante mecanismo implicado na ação antitumoral do HER-2. O trastuzumabe ligado às células cancerosas pode ser reconhecido pelos receptores Fc das células efetoras do ADCC (por exemplo, células natural killer (NK), macrófagos e granulócitos), desencadeando a atividade citotóxica dessas células imunes levando à morte das células cancerígenas. Nós nos propusemos a desenvolver um ensaio baseado em imagem para a quantificação de ADCC para identificar novos compostos moduladores do ADCC por triagem de alto conteúdo. No ensaio, células de câncer de mama JIMT-1 superexpressando HER2 são co-cultivadas com células NK-92 na presença de trastuzumabe, e a morte da célula-alvo é quantificada por microscopia automatizada e análise quantitativa de imagens. As células-alvo distinguem-se das células efetoras com base em sua fluorescência EGFP. Mostramos como bibliotecas de compostos podem ser testadas no ensaio para identificar drogas moduladoras do ADCC. Para este propósito, uma placa de teste de biblioteca de compostos foi montada usando produtos químicos finos selecionados aleatoriamente fora da prateleira do laboratório. Três compostos desestabilizadores de microtúbulos (colchicina, vincristina, podofilotoxina) que devem interferir na migração e degranulação das células NK também foram incluídos na biblioteca de testes. A tela de teste identificou todos os três compostos de controle positivo como acertos que comprovam a adequação do método para identificar drogas modificadoras do ADCC em uma biblioteca química. Com este ensaio, telas de bibliotecas de compostos podem ser realizadas para identificar compostos que aumentam o ADCC que poderiam ser usados como agentes terapêuticos adjuvantes para o tratamento de pacientes recebendo imunoterapias anticâncer. Além disso, o método também pode ser usado para identificar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis inibidores do ADCC de drogas terapêuticas tomadas por pacientes com câncer para diferentes indicações.
A imunoterapia com anticorpos anticâncer, inibidores de checkpoints imunes ou células T (CAR-T) que expressam receptores de antígenos quiméricos representa uma abordagem poderosa para o tratamento do câncer 1,2,3. O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) utilizado no tratamento do câncer de mama em estádio inicial ou metastático positivo para HER-2, bem como do câncer gástrico metastático positivo para HER-2 4,5,6. Atua....
NOTA: As principais etapas do fluxo de trabalho de ensaio são apresentadas na Figura 2.
Figura 2: Fluxo de trabalho da tela do ADCC. As células-alvo do JIMT-1-EGFP semeadas em placas HCS de 96 poços são tratadas com drogas da biblioteca de compostos. Por sua vez, células NK (efetoras) n?.......
Para demonstrar como o ensaio funciona na vida real, criamos uma biblioteca de testes de 16 compostos selecionados aleatoriamente das prateleiras do laboratório (Figura 3). Além disso, o DMSO também foi incluído como controle negativo e três compostos inibidores da polimerização de microtúbulos (colchicina, vincristina e podofilotoxina) como controles positivos. Esperava-se que estes últimos inibissem o ADCC, interferindo com a migração de células NK para as células cancerosas e.......
A reação do ADCC tem sido descrita há relativamente muito tempo. Eventos moleculares importantes do processo também foram descritos19. Os métodos de medição do ADCC vão desde o ensaio de liberação radioativa de cromo padrão-ouro, ensaios de liberação enzimática citoplasmática até vários ensaios de citometria de fluxo ou microplacas baseados em fluorescência20. No entanto, uma limitação comum desses ensaios é que eles não são passíveis de aplicativos .......
LV recebeu financiamento do National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE e OTKA K132193, K147482. As células CD16.176V.NK-92 foram obtidas do Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, em nome da Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), são protegidos por patentes em todo o mundo, e foram licenciados pela Nantkwest, lnc. Os autores agradecem a György Vereb e Árpád Szöőr por sua ajuda com o uso da linha celular NK-92 e pelo aconselhamento técnico.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
Harmony software | PerkinElmer | ||
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
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