Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Этот протокол представляет собой автоматизированный высокопроизводительный метод на основе изображений для идентификации соединений, модулирующих естественное уничтожение клеток рака молочной железы, опосредованное естественными клетками-киллерами, в присутствии терапевтического антитела против HER-2.
Иммунотерапия антиген-специфическими антителами или ингибиторами иммунных контрольных точек произвела революцию в терапии рака молочной железы. Клетки рака молочной железы, экспрессирующие рецептор эпидермального фактора роста HER2, могут быть нацелены на антитело против HER-2 трастузумаб. Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) является важным механизмом, участвующим в противоопухолевом действии HER-2. Трастузумаб, связанный с раковыми клетками, может быть распознан Fc-рецепторами эффекторных клеток ADCC (например, естественных клеток-киллеров (NK), макрофагов и гранулоцитов), запуская цитотоксическую активность этих иммунных клеток, приводящую к гибели раковых клеток. Мы решили разработать анализ на основе изображений для количественного определения ADCC для идентификации новых соединений модулятора ADCC с помощью скрининга с высоким содержанием. В анализе сверхэкспрессирующие клетки рака молочной железы HER2 JIMT-1 культивируются совместно с клетками NK-92 в присутствии трастузумаба, а гибель клеток-мишеней количественно определяется с помощью автоматической микроскопии и количественного анализа изображений. Клетки-мишени отличаются от эффекторных клеток на основе их флуоресценции EGFP. Мы показываем, как библиотеки соединений могут быть протестированы в анализе для идентификации препаратов-модуляторов ADCC. Для этой цели была установлена тестовая пластина для библиотеки соединений с использованием случайно выбранных тонких химикатов с лабораторной полки. В библиотеку тестов также были включены три дестабилизирующих соединения микротрубочек (колхицин, винкристин, подофиллотоксин), которые, как ожидается, будут препятствовать миграции и дегрануляции NK-клеток. Тестовый экран идентифицировал все три положительных контрольных соединения как попадания, доказывающие пригодность метода для идентификации ADCC-модифицирующих лекарств в химической библиотеке. С помощью этого анализа можно проводить скрининг библиотеки соединений для идентификации соединений, усиливающих ADCC, которые могут быть использованы в качестве адъювантных терапевтических агентов для лечения пациентов, получающих противоопухолевую иммунотерапию. Кроме того, метод также может быть использован для выявления любых нежелательных побочных эффектов, ингибирующих ADCC терапевтических препаратов, принимаемых онкологическими больными по различным показаниям.
Иммунотерапия противоопухолевыми антителами, ингибиторами иммунных контрольных точек или Т-клетками, экспрессирующими химерные антигенные рецепторы (CAR-T), представляет собой мощный подход к лечению рака 1,2,3. Трастузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против HER-2 (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека), используемое для лечения HER-2-положительного рака молочной железы на ранней стадии или метастатического рака молочной железы, а также HER-2-положительного метастатического рака желудка
Чтобы продемонстрировать, как анализ работает в реальной жизни, мы создали тестовую библиотеку из 16 соединений, выбранных случайным образом с лабораторных полок (рис. 3). Кроме того, ДМСО также был включен в качестве отрицательного контроля и три соединения-ингибитора по.......
Реакция ADCC была описана относительно давно. Также были описаны ключевые молекулярные события процесса19. Методы измерения ADCC варьируются от золотого стандарта анализа высвобождения радиоактивного хрома, анализов высвобождения цитоплазматических ферментов до нескольких.......
LV получила финансирование от грантов Национального управления исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS», GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE и OTKA K132193, K147482. Клетки CD16.176V.NK-92 были получены от доктора Керри С. Кэмпбелла (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, от имени Brink Biologics, lnc. Сан-Диего, Калифорния), защищены патентами по всему миру и были лицензированы Nantkwest, lnc. Авторы благодарят Дьёрдя Вереба и Арпада Сёёра за помощь в использовании клеточной линии NK-92 и за технические консультации.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
Harmony software | PerkinElmer | ||
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved