Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.
La inmunoterapia con anticuerpos antígenos específicos o inhibidores de puntos de control inmunitario ha revolucionado la terapia del cáncer de mama. Las células de cáncer de mama que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico HER2 pueden ser atacadas por el anticuerpo anti-HER-2 trastuzumab. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo importante implicado en la acción antitumoral de HER-2. El trastuzumab unido a las células cancerosas puede ser reconocido por los receptores Fc de las células efectoras ADCC (por ejemplo, células asesinas naturales [NK], macrófagos y granulocitos), lo que desencadena la actividad citotóxica de estas células inmunitarias que conduce a la muerte de las células cancerosas. Nos propusimos desarrollar un ensayo basado en imágenes para la cuantificación de ADCC para identificar nuevos compuestos moduladores de ADCC mediante cribado de alto contenido. En el ensayo, las células de cáncer de mama JIMT-1 que sobreexpresan HER2 se cultivan conjuntamente con células NK-92 en presencia de trastuzumab, y la muerte de las células diana se cuantifica mediante microscopía automatizada y análisis cuantitativo de imágenes. Las células diana se distinguen de las células efectoras en función de su fluorescencia EGFP. Mostramos cómo se pueden probar las bibliotecas de compuestos en el ensayo para identificar fármacos moduladores de ADCC. Para este propósito, se instaló una placa de prueba de biblioteca compuesta utilizando productos químicos finos seleccionados al azar del estante del laboratorio. También se incluyeron en la biblioteca de pruebas tres compuestos desestabilizadores de microtúbulos (colchicina, vincristina, podofilotoxina) que se esperaba que interfirieran con la migración y desgranulación de las células NK. La pantalla de prueba identificó los tres compuestos de control positivo como éxitos que demuestran la idoneidad del método para identificar fármacos modificadores de ADCC en una biblioteca química. Con este ensayo, se pueden realizar exámenes de biblioteca de compuestos para identificar compuestos que mejoran el ADCC que podrían usarse como agentes terapéuticos adyuvantes para el tratamiento de pacientes que reciben inmunoterapias contra el cáncer. Además, el método también se puede utilizar para identificar cualquier efecto secundario inhibidor de ADCC indeseable de los fármacos terapéuticos tomados por pacientes con cáncer para diferentes indicaciones.
La inmunoterapia con anticuerpos contra el cáncer, inhibidores de puntos de control inmunitario o células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR-T) representa un enfoque poderoso para el tratamiento del cáncer 1,2,3. Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-HER-2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano) utilizado para tratar el cáncer de mama en estadio temprano o metastásico HER-2 positivo, así como el cáncer gástrico metastásico HER-2 positivo 4,5,6
NOTA: Los pasos clave del flujo de trabajo del ensayo se presentan en la Figura 2.
Figura 2: Flujo de trabajo de la pantalla ADCC. Las células diana JIMT-1-EGFP sembradas en placas HCS de 96 pocillos se tratan con fármacos de la biblioteca de compuestos. A su vez, se agregan células NK (ef.......
Para demostrar cómo funciona el ensayo en la vida real, creamos una biblioteca de pruebas de 16 compuestos seleccionados al azar de los estantes del laboratorio (Figura 3). Además, el DMSO también se incluyó como control negativo y tres compuestos inhibidores de la polimerización de microtúbulos (colchicina, vincristina y podofilotoxina) como controles positivos. Se esperaba que estos últimos inhibieran el ADCC al interferir con la migración de células NK a las células cancerosas y.......
La reacción del ADCC se ha descrito hace relativamente mucho tiempo. También se han descrito eventos moleculares clave del proceso19. Los métodos para medir el ADCC van desde el ensayo de liberación de cromo radiactivo estándar de oro, los ensayos de liberación de enzimas citoplasmáticas hasta varios ensayos de citometría de flujo o microplacas basados en fluorescencia20. Sin embargo, una limitación común de estos ensayos es que no son susceptibles de aplicaciones.......
LV recibió fondos de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación subvenciones GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE y OTKA K132193, K147482. Las células CD16.176V.NK-92 se obtuvieron del Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, en nombre de Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), están protegidos por patentes en todo el mundo, y fueron licenciados por Nantkwest, lnc. Los autores agradecen a György Vereb y Árpád Szöőr por su ayuda con el uso de la línea celular NK-92 y por el asesoramiento técnico.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5-fluorouracil | Applichem | A7686 | in compound library |
96-well Cell Carrier Ultra plate | PerkinElmer | LLC 6055302 | |
Betulin | Sigma | B9757 | in compound library |
CD16.176V.NK92 cells | Nankwest Inc. | ||
Cerulenin | ChemCruz | sc-396822 | in compound library |
Cisplatin | Santa Cruz Biotechnology | sc-200896 | in compound library |
Colchicine | Sigma | C9754 | in compound library |
Concanavalin-A | Calbiochem | 234567 | in compound library |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | in compound library |
DMEM/F-12 medium | Sigma | D8437 | in JIMT-1 EGFP medium |
DMSO | Sigma | D2650 | in compound library |
Etoposide | Sigma | E1383 | E1383 |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Fisetin | Sigma | F4043 | in compound library |
Freedom EVO liquid handling robot | TECAN | ||
Gallotannin | Fluka Chemical Corp. | 16201 | in compound library |
Glutamine | Gibco | 35,050–061 | in NK medium |
Harmony software | PerkinElmer | ||
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma) | EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary | N/A | |
Humulin R (insulin) | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1 EGFP medium |
IL-2 | Novartis Hungária Kft. | PHC0026 | in NK medium |
Isatin | Sigma | 114618 | in compound library |
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11,140–050 | in NK medium |
Na-pyruvate | Lonza | BE13-115E | in NK medium |
Naringenin | Sigma | N5893 | in compound library |
NQDI-1 | Sigma | SML0185 | in compound library |
Opera Phenix High-Content Analysis equipment | PerkinElmer | ||
Penicillin–streptomycin | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1 EGFP and NK medium |
Pentoxyfilline | Sigma | P1784 | in compound library |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-517Q | to wash the cells |
Podophyllotoxin | Sigma | P4405 | in compound library |
Quercetin | Sigma | Q4951 | in compound library |
Tannic acid | Sigma | T8406 | in compound library |
Temozolomide | Sigma | T2577 | in compound library |
Trypan blue 0.4% solution | Sigma | T8154 | for cell counting |
Vincristine sulfate | Sigma | V0400000 | in compound library |
α-MEM | Sigma | M8042 | in NK medium |
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