Screeninganalys med högt innehåll för identifiering av antikroppsberoende cellulära cytotoxicitetsmodifierande föreningar

Detta protokoll presenterar en automatiserad, bildbaserad teknik med hög genomströmning för att identifiera föreningar som modulerar dödande av naturliga mördarcellmedierade bröstcancerceller i närvaro av en terapeutisk anti-HER-2-antikropp.

Immunterapi med antigenspecifika antikroppar eller immuncheckpointhämmare har revolutionerat behandlingen av bröstcancer. Bröstcancerceller som uttrycker den epidermala tillväxtfaktorreceptorn HER2 kan riktas mot anti-HER-2-antikroppen trastuzumab. Antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) är en viktig mekanism som är inblandad i antitumörverkan av HER-2. Trastuzumab bundet till cancerceller kan kännas igen av Fc-receptorerna i ADCC-effektorceller (t.ex. naturliga mördarceller (NK), makrofager och granulocyter), vilket utlöser den cytotoxiska aktiviteten hos dessa immunceller som leder till cancercelldöd. Vi bestämde oss för att utveckla en bildbaserad analys för kvantifiering av ADCC för att identifiera nya ADCC-modulatorföreningar genom screening med högt innehåll. I analysen samodlas HER2-överuttryckande JIMT-1-bröstcancerceller med NK-92-celler i närvaro av trastuzumab, och målcelldöd kvantifieras genom automatiserad mikroskopi och kvantitativ bildanalys. Målceller skiljer sig från effektorceller baserat på deras EGFP-fluorescens. Vi visar hur föreningsbibliotek kan testas i analysen för att identifiera ADCC-modulatorläkemedel. För detta ändamål sattes en sammansatt bibliotekstestplatta upp med slumpmässigt utvalda finkemikalier från laboratoriehyllan. Tre mikrotubulidestabiliserande föreningar (kolkicin, vinkristin, podofyllotoxin) som förväntas störa NK-cellmigration och degranulering inkluderades också i testbiblioteket. Testskärmen identifierade alla tre positiva kontrollföreningar som träffar som bevisar metodens lämplighet för att identifiera ADCC-modifierande läkemedel i ett kemiskt bibliotek. Med denna analys kan föreningsbiblioteksskärmar utföras för att identifiera ADCC-förbättrande föreningar som kan användas som adjuvansterapeutiska medel för behandling av patienter som får immunterapier mot cancer. Dessutom kan metoden också användas för att identifiera eventuella oönskade ADCC-hämmande biverkningar av terapeutiska läkemedel som tas av cancerpatienter för olika indikationer.

Immunterapi med antikroppar mot cancer, immunkontrollpunktshämmare eller chimära antigenreceptoruttryckande T (CAR-T) -celler representerar ett kraftfullt tillvägagångssätt för cancerbehandling ^1,2,3. Trastuzumab är en humaniserad monoklonal anti-HER-2 (human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2) antikropp som används för behandling av HER-2-positiv tidig stadium eller metastaserande bröstcancer, liksom HER-2-positiv metastaserad magcancer ^4,5,6. Det verkar främst genom att hämma den p....

De viktigaste stegen i analysarbetsflödet presenteras i figur 2.

Bild 2: Arbetsflöde för ADCC-skärmen. JIMT-1-EGFP-målceller sådda i 96 brunns HCS-plattor behandlas med läkemedel från föreningsbiblioteket. I sin tur tillsätts ofärgade NK (effektor) celler och trastuzumab, och platt.......

För att demonstrera hur analysen fungerar i verkligheten skapade vi ett testbibliotek med 16 föreningar som valts slumpmässigt från laboratoriehyllorna (figur 3). Dessutom inkluderades DMSO också som en negativ kontroll och tre mikrotubulipolymerisationshämmare (kolchicin, vinkristin och podofyllotoxin) som positiva kontroller. De senare förväntades hämma ADCC genom att störa NK-cellmigrationen till cancercellerna och NK-celldegranuleringen. Alla testföreningar och DMSO placerades.......

ADCC-reaktionen har beskrivits för relativt länge sedan. Viktiga molekylära händelser i processen har också beskrivits¹⁹. Metoder för mätning av ADCC sträcker sig från guldstandarden radioaktivt kromfrisättningsanalys, cytoplasmatiska enzymfrisättningsanalyser till flera fluorescensbaserade flödescytometri- eller mikroplattanalyser²⁰. En vanlig begränsning för dessa analyser är dock att de inte är mottagliga för applikationer med hög genomströmning. Tidig.......

LV fick finansiering från National Research, Development and Innovation Office-bidrag GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE och OTKA K132193, K147482. CD16.176V.NK-92 celler erhölls från Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, på uppdrag av Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), skyddas av patent över hela världen och licensierades av Nantkwest, lnc. Författarna är tacksamma för György Vereb och Árpád Szöőr för deras hjälp med användningen av NK-92-cellinjen och för teknisk rådgivning.