JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Cancer Research

Antikor Bağımlı Hücresel Sitotoksisiteyi Modifiye Eden Bileşiklerin Tanımlanması için Yüksek İçerikli Tarama Testi

Published: August 18th, 2023

DOI:

10.3791/64485

1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group
* These authors contributed equally

Bu protokol, terapötik bir anti-HER-2 antikoru varlığında doğal öldürücü hücre aracılı meme kanseri hücresi öldürmeyi modüle eden bileşikleri tanımlamak için otomatik, görüntü tabanlı yüksek verimli bir teknik sunar.

Antijene özgü antikorlar veya immün kontrol noktası inhibitörleri ile immünoterapi, meme kanseri tedavisinde devrim yaratmıştır. Epidermal büyüme faktörü reseptörü HER2'yi eksprese eden meme kanseri hücreleri, anti-HER-2 antikoru trastuzumab tarafından hedeflenebilir. Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC), HER-2'nin antitümör etkisinde rol oynayan önemli bir mekanizmadır. Kanser hücrelerine bağlı trastuzumab, ADCC efektör hücrelerinin (örneğin, doğal öldürücü (NK) hücreler, makrofajlar ve granülositler) Fc reseptörleri tarafından tanınabilir ve bu bağışıklık hücrelerinin sitotoksik aktivitesini tetikleyerek kanser hücresi ölümüne yol açar. Yüksek içerikli tarama ile yeni ADCC modülatör bileşiklerini tanımlamak için ADCC'nin nicelleştirilmesi için görüntü tabanlı bir tahlil geliştirmek üzere yola çıktık. Tahlilde, JIMT-1 meme kanseri hücrelerini aşırı eksprese eden HER2, trastuzumab varlığında NK-92 hücreleri ile birlikte kültürlenir ve hedef hücre ölümü otomatik mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi ile ölçülür. Hedef hücreler, EGFP floresanlarına göre efektör hücrelerden ayırt edilir. ADCC modülatör ilaçlarını tanımlamak için bileşik kütüphanelerin tahlilde nasıl test edilebileceğini gösteriyoruz. Bu amaçla, laboratuvar rafından rastgele seçilmiş ince kimyasallar kullanılarak bir bileşik kütüphane test plakası kuruldu. NK hücre göçü ve degranülasyonuna müdahale etmesi beklenen üç mikrotübül destabilize edici bileşik (kolşisin, vinkristin, podofillotoksin) de test kütüphanesine dahil edildi. Test ekranı, üç pozitif kontrol bileşiğinin hepsini, kimyasal bir kütüphanede ADCC modifiye edici ilaçları tanımlamak için yöntemin uygunluğunu kanıtlayan isabetler olarak tanımladı. Bu tahlil ile, antikanser immünoterapileri alan hastaların tedavisinde adjuvan terapötik ajanlar olarak kullanılabilecek ADCC arttırıcı bileşikleri tanımlamak için bileşik kütüphane ekranları yapılabilir. Ek olarak, yöntem, kanser hastaları tarafından farklı endikasyonlar için alınan terapötik ilaçların istenmeyen ADCC inhibe edici yan etkilerini tanımlamak için de kullanılabilir.

Antikanser antikorları, immün kontrol noktası inhibitörleri veya kimerik antijen reseptörü eksprese eden T (CAR-T) hücreleri ile immünoterapi, kanser tedavisine güçlü bir yaklaşımı temsil eder 1,2,3. Trastuzumab, HER-2 pozitif erken evre veya metastatik meme kanserinin yanı sıra HER-2 pozitif metastatik mide kanseri 4,5,6 tedavisinde kullanılan insanlaştırılmış bir monoklonal anti-HER-2 (insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2) antikorudur. Öncelikle epidermal büyüme faktörü

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Tahlil iş akışının temel adımları Şekil 2'de sunulmuştur.

Figure 2
Şekil 2: ADCC ekranının iş akışı. 96 kuyucuklu HCS plakasına tohumlanan JIMT-1-EGFP hedef hücreleri, bileşik kütüphanesinin ilaçlarıyla muamele edilir. Buna karşılık, lekesiz NK (efektör) hücreleri ve t.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tahlilin gerçek hayatta nasıl çalıştığını göstermek için, laboratuvar raflarından rastgele seçilen 16 bileşikten oluşan bir test kütüphanesi oluşturduk (Şekil 3). Ek olarak, DMSO ayrıca negatif kontrol olarak ve pozitif kontroller olarak üç mikrotübül polimerizasyon inhibitörü bileşiği (kolşisin, vinkristin ve podofillotoksin) dahil edildi. İkincisinin, kanser hücrelerine NK hücre göçüne ve NK hücre degranülasyonuna müdahale ederek ADCC'yi inhibe etmesi .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ADCC reaksiyonu nispeten uzun zaman önce tanımlanmıştır. Sürecin anahtar moleküler olayları da tanımlanmıştır19. ADCC'yi ölçme yöntemleri, altın standart radyoaktif krom salınım testinden, sitoplazmik enzim salınım testlerinden birkaç floresan bazlı akış sitometrisine veya mikroplaka tahlillerinekadar uzanır 20. Bununla birlikte, bu testlerin ortak bir sınırlaması, yüksek verimli uygulamalara uygun olmamalarıdır. Daha önce, ADCC modifiye edic.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LV, Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi'nden GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ve OTKA K132193, K147482 hibelerinden fon aldı. CD16.176V.NK-92 hücreleri Dr. Kerry S. Campbell'den (Fox Chase Center, Philapedlphia, PA, Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), dünya çapında patentlerle korunmaktadır ve Nantkwest, lnc tarafından lisanslanmıştır. Yazarlar, NK-92 hücre hattının kullanımı ve teknik tavsiyeler için György Vereb ve Árpád Szöőr'e teşekkür eder.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluorouracilApplichemA7686in compound library
96-well Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757in compound library
CD16.176V.NK92 cellsNankwest Inc. 
CeruleninChemCruzsc-396822in compound library
CisplatinSanta Cruz Biotechnologysc-200896in compound library
ColchicineSigmaC9754in compound library
Concanavalin-ACalbiochem234567in compound library
DexamethasoneSigmaD4902in compound library
DMEM/F-12 mediumSigmaD8437in JIMT-1 EGFP medium
DMSOSigmaD2650in compound library
EtoposideSigmaE1383E1383
Fetal bovine serum (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP and NK medium
FisetinSigmaF4043in compound library
Freedom EVO liquid handling robotTECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201in compound library
GlutamineGibco35,050–061in NK medium
Harmony software PerkinElmer
Humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, Budapest HungaryN/A
Humulin R (insulin)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP medium
IL-2Novartis Hungária Kft.PHC0026in NK medium
IsatinSigma114618in compound library
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)Gibco11,140–050in NK medium
Na-pyruvateLonzaBE13-115Ein NK medium
NaringeninSigmaN5893in compound library
NQDI-1SigmaSML0185in compound library
Opera Phenix High-Content Analysis equipmentPerkinElmer
Penicillin–streptomycinBioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP and NK medium
PentoxyfillineSigmaP1784in compound library
Phosphate buffered saline (PBS)LonzaBE17-517Qto wash the cells
PodophyllotoxinSigmaP4405in compound library
QuercetinSigmaQ4951in compound library
Tannic acidSigmaT8406in compound library
TemozolomideSigmaT2577in compound library
Trypan blue 0.4% solutionSigmaT8154for cell counting
Vincristine sulfateSigmaV0400000in compound library
α-MEMSigmaM8042in NK medium

  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013 (2022).
  3. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  4. Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
  5. Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
  6. Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
  7. Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
  8. Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261 (2021).
  9. Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581 (2021).
  10. Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
  11. van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
  12. Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
  13. Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
  14. Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
  15. Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
  16. Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
  17. Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
  18. Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
  19. Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462 (2022).
  20. Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
  21. Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved