Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Questo protocollo presenta un metodo robusto e dettagliato per ottenere sinaptosomi altamente puri, vescicole sinaptiche e altre frazioni sinaptiche dal cervello del topo. Questo metodo consente la valutazione dei processi sinaptici, compresa l'analisi biochimica della localizzazione e della funzione delle proteine con risoluzione compartimentale.
I terminali sinaptici sono i siti primari della comunicazione neuronale. La disfunzione sinaptica è un segno distintivo di molti disturbi neuropsichiatrici e neurologici. La caratterizzazione dei sottocompartimenti sinaptici mediante isolamento biochimico è, quindi, un potente metodo per chiarire le basi molecolari dei processi sinaptici, sia in salute che in malattia. Questo protocollo descrive l'isolamento dei terminali sinaptici e dei sottocompartimenti sinaptici dal cervello dei topi mediante frazionamento subcellulare. In primo luogo, le strutture terminali sinaptiche sigillate, note come sinaptosomi, vengono isolate in seguito all'omogeneizzazione del tessuto cerebrale. I sinaptosomi sono compartimenti neuronali pre e post-sinaptici con membrane pizzicate e sigillate. Queste strutture mantengono uno stato metabolicamente attivo e sono preziose per lo studio della struttura e della funzione sinaptica. I sinaptosomi vengono quindi sottoposti a lisi ipotonica e ultracentrifugazione per ottenere sottocompartimenti sinaptici arricchiti per vescicole sinaptiche, citosol sinaptico e membrana plasmatica sinaptica. La purezza della frazione è confermata dalla microscopia elettronica e dall'analisi dell'arricchimento biochimico per proteine specifiche dei compartimenti sub-sinaptici. Il metodo presentato è uno strumento semplice e prezioso per studiare le caratteristiche strutturali e funzionali della sinapsi e l'eziologia molecolare di vari disturbi cerebrali.
Le sinapsi sono le unità computazionali di base del cervello attraverso le quali i neuroni comunicano ed esercitano funzioni diverse e squisitamente complesse. Le sinapsi sono, quindi, fondamentali per la salute del cervello1; La disfunzione sinaptica è implicata come fonte o risultato di molti disturbi2. Le sinapsi sono costituite da terminali pre- e post-sinaptici, estensioni di due diversi neuroni che sono strettamente apposti e separati da una fessura sinaptica attraversata da molecole di adesione sinaptica. Le informazioni fluiscono dal compartimento pre- al post-sinaptico sotto forma di messaggeri chimici chiamati neurotrasmettitori1. I processi molecolari coinvolti nella neurotrasmissione sono aree attive di ricerca 3,4,5. Comprendere i processi patogenetici all'interno dei terminali sinaptici e la risposta delle sinapsi alla patologia in altri sotto-compartimenti neuronali sono passi cruciali per affrontare i disturbi del cervello 1,2. Diversi progressi metodologici, applicati prevalentemente a modelli murini, hanno fatto avanzare questa ricerca6. L'isolamento delle frazioni sinaptiche mediante centrifugazione differenziale è uno di questi metodi di cambiamento di paradigma che ha permesso la valutazione dettagliata dei processi sinaptici in salute e malattia.
Il cervello umano adulto è costituito da 80-90 miliardi di neuroni 7,8. Tra le specie murine, il cervello del ratto contiene circa ~ 200 milioni di neuroni, mentre i topi hanno ~ 70 milioni 9,10. Ogni neurone forma migliaia di connessioni sinaptiche specifiche con una rete di neuroni altamente polarizzati mescolati con cellule gliali e vascolarizzazione densa. In un tessuto così complesso ed eterogeneo, un tempo era impensabile isolare e studiare le sinapsi come un sistema indipendente. Nel 1960, Victor Whittaker, Catherine Hebb e altri hanno reso possibile questo isolando terminali sinaptici intatti usando il frazionamento subcellulare11,12,13,14. Nel tentativo di isolare le vescicole sinaptiche (SV), hanno omogeneizzato i cervelli attraverso la forza di taglio liquido nel saccarosio iso-osmotico (0,32 M) seguita da ultracentrifugazione. Hanno ottenuto terminali nervosi o varicosità intatte, chiusi in membrana plasmatica, che hanno chiamato particelle nervose (NEP)11,13. Poiché le caratteristiche strutturali e funzionali della sinapsi sono state preservate in queste strutture, le NEP sono state successivamente definite "sinaptosomi" per congruenza con altri organelli subcellulari13,15. Vale la pena notare che il lavoro di Eduardo de Robertis e colleghi, che hanno coniato il termine "vescicola sinaptica", si è sovrapposto a quello di Whittaker e colleghi e ha contribuito alla convalida dell'isolamento e della caratterizzazione del "sinaptosoma"16,17,18.
I sinaptosomi sono strutture fisiologicamente attive che contengono tutte le proprietà cellulari e molecolari necessarie per la conservazione, il rilascio e la ricaptazione dei neurotrasmettitori13,18. Anche la conservazione delle caratteristiche sinaptiche chiave in vitro e l'assenza di componenti non sinaptici contribuiscono all'utilità di questo metodo di isolamento. I sinaptosomi hanno contribuito immensamente alla comprensione delle proprietà chimiche e fisiologiche della neurotrasmissione e vengono ora utilizzati per studiare i processi molecolari sinaptici e le loro alterazioni nella malattia 19,20,21,22,23. I sinaptosomi sono anche il materiale di partenza iniziale per isolare componenti sinaptici come SV, vescicole rivestite di clatrina (CCV), citosol sinaptico, membrana plasmatica sinaptica, mitocondri sinaptici, molecole di adesione sinaptica e altri componenti di interesse, che possono facilitare la comprensione dei meccanismi molecolari della funzione sinaptica 18,19,20,24,25,26, 27,28. Questi componenti sub-sinaptici possono essere ottenuti mediante lisi osmotica dei sinaptosomi e ultracentrifugazione del gradiente di densità del saccarosio15,29. Sebbene il metodo di frazionamento subcellulare originale del gruppo di ricerca di Whittaker sia noto per essere efficiente nell'isolare sinaptosomi di qualità e SV 13,30, recenti ottimizzazioni migliorano la purezza delle frazioni subcellulari 22,23,31,32. Questo articolo fornisce una versione altamente dettagliata e accessibile di un protocollo classico per il frazionamento subcellulare del tessuto cerebrale murino per isolare sinaptosomi, SV e altri componenti sub-sinaptici.
Tutti gli esperimenti con i topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Yale (protocollo 2021-11117) ed eseguiti in una struttura accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International (AAALAC). La cura e la stabulazione degli animali erano conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio33 e sono state fornite dallo Yale Animal Resource Center (YARC). Gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum al cibo e all'acqua. Sono necessari da cinque a otto topi o da due a quattro ratti per genotipo o condizione per il seguente protocollo. Sono necessari meno ratti a causa dei loro maggiori volumi cerebrali. Allo stesso modo, l'età degli animali da esperimento può influenzare la resa frazionaria; Altri topi possono essere necessari per età inferiori a 2 mesi. In caso contrario, le procedure descritte si applicano sia alle specie murine che agli animali adulti sani di qualsiasi età. I dati rappresentativi presentati in questo studio hanno utilizzato topi wild-type (C57BL / 6J) (età = 2 mesi; quattro maschi e quattro femmine per replica) ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione sperimentale
NOTA: Questo protocollo richiede ~ 11 h per un singolo ricercatore da completare. Si consiglia vivamente di completare la configurazione da banco (Figura 1), la preparazione del buffer (Tabella 1), il preraffreddamento di centrifughe e rotori a 4 °C e la raccolta e l'etichettatura dei materiali e delle attrezzature necessari (vedere Tabella dei materiali) il giorno prima dell'esecuzione del protocollo, ove applicabile.
Figura 1: Configurazione da banco. Prima delle dissezioni cerebrali, (A) gli omogeneizzatori di vetro Dounce e (B) tutti i tamponi sono stati raffreddati su ghiaccio. (C) Le soluzioni madre di inibitori della proteasi sono state scongelate sul ghiaccio. Sono stati ottenuti un secondo contenitore di ghiaccio umido per provette da centrifuga, un Dewar di azoto liquido (non mostrato) e (D) un contenitore di ghiaccio secco per la conservazione a breve termine dei campioni congelati in azoto liquido. (E) Le provette per microcentrifuga sono state pre-marcate per tutti i campioni, poiché durante questa procedura sono state raccolte quattro aliquote di ciascun campione di frazione subcellulare per genotipo o condizione (suggerimento che consente di risparmiare tempo: etichettare accuratamente tutte le provette il giorno prima dell'esecuzione dell'esperimento). (F) Un contenitore per rifiuti a rischio biologico appropriato, (G) etanolo al 70%, (H) strumenti chirurgici e (I) un tampone assorbente. Le provette da centrifuga e gli articoli monouso necessari sono stati accantonati per un accesso efficiente durante l'implementazione del protocollo (non mostrato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione dei tamponi di frazionamento subcellulare. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 2: Panoramica del protocollo di frazionamento subcellulare. Schema riassuntivo delle fasi di frazionamento subcellulare e dei campioni raccolti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Escissione cerebrale del topo
Figura 3: Anatomia craniofacciale . (A) Vista dorsale di un cranio di topo con le relative strutture craniche indicate. (B) Vista laterale sinistra del cranio e del cervello di un topo con le relative strutture craniche e direzioni anatomiche indicate. Le linee tratteggiate rappresentano le posizioni in cui devono essere eseguite le incisioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Preparazione del sinaptosoma
Nota : gli schemi di questa procedura sono illustrati nella Figura 4.
Figura 4: Preparazione del sinaptosoma. Schema della fase 3, la generazione dei sinaptosomi (P2'). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Lisi ipotonica
Nota : gli schemi di questa procedura sono illustrati nella Figura 5.
Figura 5: Lisi ipotonica. Schema della fase 4, la lisi ipotonica dei sinaptosomi per generare la lisi supernatante (LS1) e le frazioni di membrana sinaptosomiale (LP1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Isolamento della vescicola sinaptica
Nota : gli schemi di questa procedura sono illustrati nella Figura 6.
Figura 6: Isolamento della vescicola sinaptica e isolamento della membrana plasmatica sinaptica. (A) Schema della fase 5, l'isolamento delle frazioni di citosol sinaptico (LS2) e vescicola sinaptica (LP2) e (B) fase 6, la generazione di mielina (MF), membrana plasmatica sinaptica (SPM) e frazioni mitocondriali (Mito.) dopo l'ultracentrifugazione dei gradienti di saccarosio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
6. Isolamento della membrana plasmatica sinaptica
Il metodo presentato si traduce in 11 frazioni subcellulari cerebrali che possono essere sottoposte a ulteriore purificazione e varie forme di analisi a valle35,36. Il metodo gold standard per valutare la qualità dei sinaptosomi, SVs23 e altri componenti è la microscopia elettronica (EM) (Figura 7). L'immunoblotting quantitativo per proteine presenti in specifiche frazioni subcellulari può anche essere eseguito per valutare i marcatori di purezza della frazione (Figura 8). Ad esempio, l'analisi immunoblot delle frazioni rivela l'arricchimento di N-caderina (CDH2, nome UniProt) nella frazione di membrana plasmatica sinaptica (SPM), α-sinucleina (SYUA) nel citosol sinaptico (LS2), sinaptofisina (SYPH) nella frazione vescicola sinaptica (LP2) e proteina basica della mielina (MBP) nella frazione mielinica (MF) rispetto ai livelli proteici nell'omogenato iniziale dell'intero cervello (totale) (Figura 8 ). Una volta stabilita la purezza della frazione (ad esempio, si noti l'assenza di CDH2 nella frazione LS2 o l'aumento di molte volte di SYPH nella frazione LP2), l'immunoblotting quantitativo può essere utilizzato per determinare la localizzazione delle proteine di interesse o interrogare le differenze nella distribuzione delle proteine tra genotipi o trattamenti. Comprendere la localizzazione subcellulare delle proteine sinaptiche può consentire la dissezione di funzioni proteiche precedentemente non descritte. Inoltre, questo metodo può chiarire i difetti del traffico o la disfunzione sinaptica negli stati patologici, specialmente se abbinato a saggi funzionali. Ad esempio, il nostro team ha utilizzato questo metodo per identificare un pool di tioesterasi 1 della proteina palmitoil enzimaticamente attiva che è arricchita nel citosol sinaptico19.
Figura 7: Microscopia elettronica (EM) dei sinaptosomi. (A) Immagine EM rappresentativa di un sinaptosoma contenente vescicole sinaptiche (freccia). (B) Immagine EM rappresentativa di un sinaptosoma con componenti pre- (freccia) e post-sinaptica (doppia freccia). (C) Immagine EM rappresentativa di un sinaptosoma contenente vescicole sinaptiche e un mitocondrio (freccia) (barre della scala = 100 nm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Analisi immunoblot delle frazioni subcellulari. (A) I marcatori di purezza della frazione subcellulare (indicati con la nomenclatura UniProt) sono opportunamente localizzati rispetto all'omogenato dell'intero cervello (totale): N-caderina (CDH2) nella frazione sinaptica della membrana plasmatica (SPM), sinaptofisina 1 (SYPH) e sinaptojanina 1 (SYNJ1) nella frazione arricchita di vescicole sinaptiche (LP2), α-sinucleina (SYUA) nel citosol sinaptico (LS2), e la proteina basica della mielina (MBP) nella frazione mielinica (MF). (B) L'analisi di quantificazione immunoblot rivela l'arricchimento (variazione di piega rispetto al totale) dei marcatori di purezza frazionaria. I dati sono rappresentati come media ± deviazione standard su una scala log10. La linea tratteggiata indica un cambiamento di 1,5 volte (y = 0,176) (n = 3 esperimenti replicati con 8 topi wild-type; età = 2 mesi; n = 4-5 macchie per SYPH, SYUA, MBP, con n = 3 valori tracciati precedentemente pubblicati da Gorenberg et al.19; n = 5 per SYNJ1; n = 1 per CDH2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Nei loro studi seminali, Whittaker e colleghi hanno utilizzato quattro criteri morfologici per identificare i sinaptosomi: (1) le strutture hanno una membrana plasmatica sigillata; (2) le strutture contengono SV simili a quelle delle terminazioni nervose e varicosità in situ per dimensioni e numero; (3) le strutture possiedono uno o più piccoli mitocondri; e (4) la membrana presinaptica è frequentemente aderente a una componente post-sinaptica11,12,13. Sebbene i primi due criteri si applichino generalmente a ogni metodo di isolamento, nei protocolli più recenti descritti in questo articolo, non tutti i sinaptosomi risultanti avranno mitocondri e terminali post-sinaptici collegati. Circa il 60% dei sinaptosomi avrà mitocondri e si stima che solo fino al 15% abbia attaccato terminali post-sinaptici37. Se le componenti post-sinaptiche sono di particolare interesse, l'uso di un tampone di omogeneizzazione isotonico simile a Krebs e la filtrazione a pressione per l'arricchimento sono noti per produrre alte concentrazioni di sinaptosomi con terminali post-sinaptici (chiamati anche sinaptoneurosomi)22,38.
Il metodo di sacrificare l'animale può influire sulla qualità dei sinaptosomi e delle sottofrazioni sinaptiche. Gli animali adulti sacrificati con un metodo di eutanasia che non richiede l'anestesia si tradurranno nella migliore qualità della frazione. Inoltre, i cervelli dovrebbero essere appena sezionati, non congelati e omogeneizzati usando un rapporto 1:10 di tampone di omogeneizzazione (peso / volume) per le frazioni sinaptiche più vitali22. Il cervello ha una popolazione eterogenea di sinapsi che possono essere differenziate dal tipo di neurotrasmettitori che trasportano. La formazione del sinaptosoma non è generalmente influenzata dal tipo di sinapsi o dal contenuto di neurotrasmettitori13. Un'eccezione sono le fibre muschiose nel cervelletto, che sono note per essere interrotte in condizioni ottimali per ottenere sinaptosomi dal resto del cervello39,40. Pertanto, la rimozione del cervelletto prima dell'omogeneizzazione del cervello è raccomandata se l'esclusione di questa regione non influisce sull'obiettivo sperimentale. Se interessati a isolare i sinaptosomi di un particolare carattere di neurotrasmettitore, le aree del cervello che sono arricchite per i neuroni contenenti il neurotrasmettitore di interesse possono prima essere isolate. Tuttavia, questo approccio imporrà limitazioni alla resa della frazione finale, a seconda delle dimensioni della regione di interesse (anche l'età degli animali è quindi una considerazione). Esistono metodi immunochimici per l'isolamento dei sinaptosomi specifici dei neurotrasmettitori, ma la vitalità e la resa saranno significativamente compromesse22. Se la valutazione della vitalità metabolica del sinaptosoma è importante, può essere impiegata la misurazione del rilascio di neurotrasmettitori 41,42 o alcuni saggi enzimatici43.
I contaminanti comuni nei preparati di sinaptosomi includono microsomi, mitocondri liberi, SV e membrane neuronali e gliali. La contaminazione può essere ridotta aumentando il numero di lavaggi alle frazioni P1 e P222 ed evitando la risospensione del pellet mitocondriale rosso nelle fasi successive. Negli esperimenti in cui la vitalità metabolica e il tempo sono cruciali, ridurre il numero di lavaggi e utilizzare gradienti di Ficoll o Percoll su gradienti di saccarosio sarà utile44,45,46. Questi metodi riducono anche significativamente la contaminazione. Il protocollo originale di Whittaker produceva SV di alta qualità. Un'ulteriore ottimizzazione di Nagy et al.23, inclusa in questo metodo, produce SV con notevole omogeneità e purezza senza compromettere significativamente la resa36. Se specifici sottotipi di SV sono di interesse, come le SV glutammatergiche (contenenti VGLUT-1) o GABAergiche (contenenti VGAT-1), l'immunoisolamento con anticorpi specifici può essere eseguito47,48. Sono disponibili anche metodi alternativi per isolare i CCV dai sinaptosomi, che, a causa della densità differenziale, potrebbero non essere presenti nella stessa interfaccia delle SV ottenute con questo metodo20,49,50.
Nel complesso, l'attuale protocollo per isolare i componenti sinaptici può essere ulteriormente ottimizzato per ottenere frazioni con maggiore omogeneità e vitalità in base alla qualità e alla quantità del tessuto cerebrale sorgente e agli obiettivi sperimentali. Per ulteriori dettagli sulla risoluzione dei problemi, si dovrebbe fare riferimento ai capitoli dei libri di Dunkley e Robinson22 e Ganzella et al.36.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamo P. Colosi per la preparazione delle immagini EM. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) e Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Abbiamo creato illustrazioni grafiche utilizzando BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
Pipette Tips | |||
Serological Pipettes | |||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved