Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Este protocolo apresenta um método robusto e detalhado para obter sinaptossomos, vesículas sinápticas e outras frações sinápticas altamente puras do cérebro de camundongos. Este método permite a avaliação de processos sinápticos, incluindo a análise bioquímica da localização e função de proteínas com resolução compartimental.
Os terminais sinápticos são os principais locais de comunicação neuronal. A disfunção sináptica é uma característica de muitos distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicos. A caracterização de subcompartimentos sinápticos por isolamento bioquímico é, portanto, um método poderoso para elucidar as bases moleculares dos processos sinápticos, tanto na saúde quanto na doença. Este protocolo descreve o isolamento de terminais sinápticos e subcompartimentos sinápticos de cérebros de camundongos por fracionamento subcelular. Primeiro, estruturas terminais sinápticas seladas, conhecidas como sinaptossomos, são isoladas após a homogeneização do tecido cerebral. Os sinaptossomos são compartimentos neuronais pré e pós-sinápticos com membranas pinçadas e seladas. Essas estruturas retêm um estado metabolicamente ativo e são valiosas para o estudo da estrutura e função sináptica. Os sinaptossomos são então submetidos à lise hipotônica e ultracentrifugação para obtenção de subcompartimentos sinápticos enriquecidos para vesículas sinápticas, citosol sináptico e membrana plasmática sináptica. A pureza da fração é confirmada por microscopia eletrônica e análise de enriquecimento bioquímico para proteínas específicas de compartimentos subsinápticos. O método apresentado é uma ferramenta direta e valiosa para estudar as características estruturais e funcionais da sinapse e a etiologia molecular de vários distúrbios cerebrais.
Sinapses são as unidades computacionais básicas do cérebro através das quais os neurônios se comunicam e exercem funções diversas e requintadamente complexas. As sinapses são, portanto, fundamentais para a saúde do cérebro1; a disfunção sináptica está implicada como fonte ou resultado de muitos distúrbios2. As sinapses são constituídas por terminais pré e pós-sinápticos, extensões de dois neurônios diferentes que são estreitamente apostos e separados por uma fenda sináptica atravessada por moléculas de adesão sináptica. A informação flui do compartimento pré para o pós-sináptico na forma de mensageiros químicos chamados neurotransmissores1. Os processos moleculares envolvidos na neurotransmissão são áreas ativas de pesquisa 3,4,5. Compreender os processos patogênicos dentro dos terminais sinápticos e a resposta das sinapses à patologia em outros subcompartimentos neuronais são passos cruciais para o enfrentamento de distúrbios cerebrais 1,2. Diversos avanços metodológicos, predominantemente aplicados aos modelos murinos, têm avançado nessa busca6. O isolamento de frações sinápticas por centrifugação diferencial é um desses métodos de mudança de paradigma que permitiu a avaliação detalhada dos processos sinápticos na saúde e na doença.
O cérebro humano adulto consiste em 80-90 bilhões de neurônios 7,8. Entre as espécies murinas, o cérebro do rato contém aproximadamente ~ 200 milhões de neurônios, enquanto os ratos têm ~ 70 milhões 9,10. Cada neurônio forma milhares de conexões sinápticas específicas com uma rede de neurônios altamente polarizados misturados com células gliais e vasculatura densa. Em tecidos tão complexos e heterogêneos, já foi impensável isolar e estudar sinapses como um sistema independente. Na década de 1960, Victor Whittaker, Catherine Hebb e outros tornaram isso possível isolando terminais sinápticos intactos usando fracionamento subcelular11,12,13,14. Na tentativa de isolar vesículas sinápticas (SVs), homogeneizaram cérebros através de força de cisalhamento líquido em sacarose iso-osmótica (0,32 M) seguida de ultracentrifugação. Obtiveram terminais ou varicosidades nervosas intactas, pinçadas e fechadas na membrana plasmática, que denominaram partículas de terminação nervosa (NEPs)11,13. Como as características estruturais e funcionais da sinapse foram preservadas nessas estruturas, os NEPs foram posteriormente denominados "sinaptossomos" por congruência com outras organelas subcelulares13,15. Vale ressaltar que o trabalho de Eduardo de Robertis e colegas, que cunharam o termo "vesícula sináptica", sobrepôs-se ao de Whittaker e colegas e contribuiu para a validação do isolamento e caracterização dos "sinaptossomos"16,17,18.
Os sinaptossomos são estruturas fisiologicamente ativas que contêm todas as propriedades celulares e moleculares necessárias para o armazenamento, liberação e recaptação de neurotransmissores13,18. A preservação das principais características sinápticas in vitro e a ausência de componentes não sinápticos também contribuem para a utilidade deste método de isolamento. Os sinaptossomos têm contribuído imensamente para a compreensão das propriedades químicas e fisiológicas da neurotransmissão e agora estão sendo utilizados para estudar os processos moleculares sinápticos e suas alterações na doença 19,20,21,22,23. Os sinaptossomos também são o material de origem inicial para o isolamento de componentes sinápticos como SVs, vesículas revestidas de clatrina (CCVs), citosol sináptico, membrana plasmática sináptica, mitocôndrias sinápticas, moléculas de adesão sináptica e outros componentes de interesse, o que pode facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares da função sináptica18,19,20,24,25,26, 27,28. Esses componentes subsinápticos podem ser obtidos pela lise osmótica dos sinaptossomos e ultracentrifugação do gradiente de densidade da sacarose15,29. Embora o método original de fracionamento subcelular do grupo de pesquisa de Whittaker seja conhecido por ser eficiente no isolamento de sinaptossomos de qualidade e SVs 13,30, otimizações recentes aumentam a pureza das frações subcelulares 22,23,31,32. Este artigo fornece uma versão altamente detalhada e acessível de um protocolo clássico para o fracionamento subcelular do tecido cerebral murino para isolar sinaptossomos, SVs e outros componentes subsinápticos.
Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Yale (Protocolo 2021-11117) e realizados em uma instalação credenciada pela Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Os cuidados com os animais e o alojamento estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório33 e foram fornecidos pelo Yale Animal Resource Center (YARC). Os animais foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso ad libitum a alimentos e água. Cinco a oito camundongos ou dois a quatro ratos por genótipo ou condição são necessários para o seguinte protocolo. Menos ratos são necessários devido aos seus maiores volumes cerebrais. Do mesmo modo, a idade dos animais de experiência pode afectar o rendimento das fracções; camundongos adicionais podem ser necessários para idades inferiores a 2 meses. Caso contrário, os procedimentos descritos aplicam-se tanto a espécies murinas como a animais adultos saudáveis de qualquer idade. Os dados representativos apresentados neste estudo utilizaram camundongos do tipo selvagem (C57BL/6J) (idade = 2 meses; quatro machos e quatro fêmeas por repetição) obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Preparação experimental
NOTA: Este protocolo requer ~11 h para que um único pesquisador seja concluído. É altamente recomendável concluir a configuração da bancada (Figura 1), a preparação do tampão (Tabela 1), o pré-resfriamento de centrífugas e rotores a 4 °C e a coleta e rotulagem dos materiais e equipamentos necessários (consulte Tabela de Materiais) no dia anterior à execução do protocolo, quando aplicável.
Figura 1: Configuração de bancada. Antes das dissecações cerebrais, (A) homogeneizadores de vidro de rejeição e (B) todos os tampões foram resfriados no gelo. (C) As soluções-mãe dos inibidores da protease foram descongeladas no gelo. Um segundo recipiente de gelo úmido para tubos de centrífuga, um Dewar de nitrogênio líquido (não mostrado) e (D) um recipiente de gelo seco para armazenamento de curto prazo das amostras congeladas em nitrogênio líquido foram obtidos. (E) Os tubos de microcentrífuga foram pré-marcados para todas as amostras, pois quatro alíquotas de cada amostra de fração subcelular por genótipo ou condição foram coletadas durante este procedimento (dica de economia de tempo: rotule cuidadosamente todos os tubos no dia anterior à realização do experimento). (F) Um recipiente apropriado de resíduos de risco biológico, (G) etanol a 70%, (H) ferramentas cirúrgicas e (I) uma almofada de superfície absorvente. Os tubos de centrífuga e descartáveis necessários foram reservados para acesso eficiente durante a implementação do protocolo (não mostrado). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição dos tampões de fracionamento subcelular. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Figura 2: Visão geral do protocolo de fracionamento subcelular. Esquema resumido das etapas de fracionamento subcelular e amostras coletadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Excisão do cérebro do rato
Figura 3: Anatomia craniofacial . (A) Vista dorsal de um crânio de rato com estruturas cranianas relevantes indicadas. (B) Vista lateral esquerda do crânio e do cérebro de um rato com estruturas cranianas relevantes e direções anatômicas indicadas. As linhas tracejadas representam os locais onde as incisões devem ser feitas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Preparação do sinaptossoma
Observação : os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 4.
Figura 4: Preparação do sinaptossoma. Esquema do passo 3, a geração de sinaptossomos (P2'). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Lise hipotônica
NOTA: Os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 5.
Figura 5: Lise hipotônica. Esquema do passo 4, a lise hipotônica dos sinaptossomos para gerar o sobrenadante de lise (LS1) e frações de membrana sinaptossomal (LP1). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Isolamento da vesícula sináptica
NOTA: Os esquemas desse procedimento são mostrados na Figura 6.
Figura 6: Isolamento da vesícula sináptica e isolamento da membrana plasmática sináptica. (A) Esquema da etapa 5, o isolamento das frações citosol sináptico (LS2) e vesícula sináptica (LP2) e (B) etapa 6, a geração de mielina (MF), membrana plasmática sináptica (SPM) e frações mitocondriais (Mito.) após a ultracentrifugação de gradientes de sacarose. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Isolamento da membrana plasmática sináptica
O método apresentado resulta em 11 frações subcelulares cerebrais que podem ser submetidas a uma purificação adicional e a várias formas de análise a jusante35,36. O método padrão-ouro para avaliar a qualidade dos sinaptossomos, SVs23 e outros componentes é a microscopia eletrônica (EM) (Figura 7). O immunoblotting quantitativo para proteínas presentes em frações subcelulares específicas também pode ser realizado para avaliar marcadores de pureza de fração (Figura 8). Por exemplo, a análise imunoblot das frações revela o enriquecimento da N-caderina (CDH2, nome UniProt) na fração da membrana plasmática sináptica (SPM), α-sinucleína (SYUA) no citosol sináptico (LS2), sinaptofisina (SYPH) na fração vesícula sináptica (LP2) e proteína básica de mielina (MBP) na fração de mielina (MF) quando comparada aos níveis de proteína no homogeneizado cerebral completo inicial (Total) (Figura 8 ). Uma vez que a pureza da fração tenha sido estabelecida (por exemplo, observe a ausência de CDH2 na fração LS2 ou o aumento de muitas vezes no SYPH na fração LP2), o immunoblotting quantitativo pode ser usado para determinar a localização de proteínas de interesse ou consultar diferenças na distribuição de proteínas entre genótipos ou tratamentos. Compreender a localização subcelular de proteínas sinápticas pode permitir a dissecção de funções proteicas não descritas anteriormente. Além disso, esse método pode elucidar defeitos de tráfico ou disfunção sináptica em estados de doença, especialmente quando emparelhado com ensaios funcionais. Por exemplo, nossa equipe usou esse método para identificar um pool de proteína palmitoila tioesterase 1 enzimaticamente ativa que é enriquecida no citosol sináptico19.
Figura 7: Microscopia eletrônica (EM) de sinaptossomos. (A) Imagem EM representativa de um sinaptossomo contendo vesículas sinápticas (seta). (B) Imagem EM representativa de um sinaptossomo com componentes pré (seta) e pós-sinápticos (seta dupla). (C) Imagem EM representativa de um sinaptossomo contendo vesículas sinápticas e uma mitocôndria (seta) (barras de escala = 100 nm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de imunoblot das frações subcelulares. (A) Os marcadores de pureza da fração subcelular (indicados com a nomenclatura UniProt) estão adequadamente localizados em comparação com o homogeneizado do cérebro inteiro (total): N-caderina (CDH2) na fração da membrana plasmática sináptica (SPM), sinaptofisina 1 (SYPH) e sinaptojanina 1 (SYNJ1) na fração enriquecida da vesícula sináptica (LP2), α-sinucleína (SYUA) no citosol sináptico (LS2), e proteína básica de mielina (MBP) na fração de mielina (MF). (B) A análise de quantificação de immunoblot revela o enriquecimento (mudança de dobra em relação ao total) dos marcadores de pureza de fração. Os dados são representados como média ± desvio padrão em uma escala log10. A linha pontilhada indica uma mudança de 1,5 vezes (y = 0,176) (n = 3 replicar experimentos com 8 camundongos do tipo selvagem; idade = 2 meses; n = 4-5 manchas para SYPH, SYUA, MBP, com n = 3 valores plotados previamente publicados por Gorenberg et al.19; n = 5 para SYNJ1; n = 1 para CDH2). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seus estudos seminais, Whittaker e seus colegas usaram quatro critérios morfológicos para identificar sinaptossomos: (1) as estruturas têm uma membrana plasmática selada; (2) as estruturas contêm SVs semelhantes às dos terminais nervosos e varicosidades in situ em tamanho e número; (3) as estruturas possuem uma ou mais pequenas mitocôndrias; e (4) a membrana pré-sináptica é frequentemente aderida a um componente pós-sináptico11,12,13. Embora os dois primeiros critérios geralmente se apliquem a todos os métodos de isolamento, nos protocolos mais recentes descritos neste artigo, nem todos os sinaptossomos resultantes terão mitocôndrias e terminais pós-sinápticos ligados. Aproximadamente 60% dos sinaptossomos terão mitocôndrias, e estima-se que apenas até 15% tenham terminais pós-sinápticos anexados37. Se os componentes pós-sinápticos são de particular interesse, sabe-se que o uso de um tampão de homogeneização isotônico semelhante ao Krebs e filtração por pressão para enriquecimento produz altas concentrações de sinaptossomos com terminais pós-sinápticos (também denominados sinaptoneurossomas)22,38.
O método de sacrifício do animal pode afetar a qualidade dos sinaptossomos e subfrações sinápticas. Animais adultos sacrificados usando um método de eutanásia que não requer anestesia resultarão na melhor qualidade de fração. Além disso, os cérebros devem ser recém-dissecados, não congelados e homogeneizados usando uma proporção de 1:10 de tampão de homogeneização (peso/volume) para as frações sinápticas mais viáveis22. O cérebro tem uma população heterogênea de sinapses que podem ser diferenciadas pelo tipo de neurotransmissores que carregam. A formação de sinaptossomas geralmente não é afetada pelo tipo de sinapse ou conteúdo de neurotransmissores13. Uma exceção são as fibras musgosas no cerebelo, que são conhecidas por serem interrompidas em condições ótimas para a obtenção de sinaptossomos do resto do cérebro39,40. Assim, recomenda-se a remoção do cerebelo antes da homogeneização cerebral se a exclusão dessa região não afetar o objetivo experimental. Se estiver interessado em isolar sinaptossomos de um caráter neurotransmissor particular, áreas do cérebro que são enriquecidas para neurônios contendo o neurotransmissor de interesse podem primeiro ser isoladas. No entanto, essa abordagem imporá limitações ao rendimento da fração final, dependendo do tamanho da região de interesse (a idade dos animais também é, portanto, uma consideração). Existem métodos imunoquímicos para o isolamento de sinaptossomos neurotransmissores específicos, mas a viabilidade e o rendimento serão significativamente comprometidos22. Se a avaliação da viabilidade metabólica dos sinaptossomos for importante, a medida da liberação de neurotransmissores41,42 ou certos ensaios enzimáticos 43 pode ser empregada.
Contaminantes comuns em preparações de sinaptossomos incluem microssomos, mitocôndrias livres, SVs e membranas neuronais e gliais. A contaminação pode ser reduzida aumentando o número de lavagens nas frações P1 e P222 e evitando a ressuspensão do pellet mitocondrial vermelho nas etapas subsequentes. Em experimentos em que a viabilidade metabólica e o tempo são cruciais, a redução do número de lavagens e o uso de gradientes de Ficoll ou Percoll sobre gradientes de sacarose serão úteis 44,45,46. Esses métodos também reduzem significativamente a contaminação. O protocolo original de Whittaker produziu SVs de alta qualidade. A otimização adicional por Nagy et al.23, incluída nesse método, produz VS com notável homogeneidade e pureza, sem comprometer significativamente o rendimento36. Se subtipos específicos de VS forem de interesse, como SVs glutamatérgicos (contendo VGLUT-1) ou GABAérgicos (contendo VGAT-1), o imunoisolamento com anticorpos específicos pode ser realizado47,48. Métodos alternativos também estão disponíveis para isolar CCVs de sinaptossomos, que, devido à densidade diferencial, podem não estar presentes na mesma interface que as SVs obtidas com esse método20,49,50.
No geral, o presente protocolo para isolar componentes sinápticos pode ser ainda mais otimizado para obter frações com melhor homogeneidade e viabilidade com base na qualidade e quantidade do tecido cerebral de origem e nos objetivos experimentais. Para maiores detalhes sobre a solução de problemas, deve-se consultar os capítulos de livros de Dunkley e Robinson22 e Ganzella et al.36.
Os autores não têm nada a revelar.
Gostaríamos de agradecer a P. Colosi pela preparação da imagem EM. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), do Departamento de Defesa dos Estados Unidos (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinson's (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) e o Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Criamos ilustrações gráficas usando BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
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High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
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Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
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Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
Pipette Tips | |||
Serological Pipettes | |||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
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TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |
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