Kultur og billeddannelse af ex vivo organotypiske pseudomyxoma peritonei tumorskiver fra resekterede humane tumorprøver

Vi beskriver en protokol for produktion, kultur og visualisering af humane kræftformer, som har metastaseret til peritoneale overflader. Resected tumorprøver skæres ved hjælp af et vibratomt og dyrkes på permeable indsatser for øget iltning og levedygtighed, efterfulgt af billeddannelse og nedstrømsanalyser ved hjælp af konfokal mikroskopi og flowcytometri.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjælden tilstand, der skyldes spredning af en mucinøs primær tumor og den resulterende ophobning af mucinudskillende tumorceller i bughulen. PMP kan opstå fra forskellige typer kræftformer, herunder appendiceal, ovarie og kolorektal, selvom appendiceal neoplasmer er langt den mest almindelige ætiologi. PMP er udfordrende at studere på grund af dets (1) sjældenhed, (2) begrænsede murinmodeller og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden, der præsenteres her, tillader visualisering og forhør i realtid af disse tumortyper ved hjælp af patientafledte ex vivo organotypiske skiver i et præparat, hvor tumormikromiljøet (TME) forbliver intakt. I denne protokol beskriver vi først forberedelsen af tumorskiver ved hjælp af et vibratomt og efterfølgende langsigtet kultur. For det andet beskriver vi konfokal billeddannelse af tumorskiver og hvordan man overvåger funktionelle aflæsninger af levedygtighed, calciumbilleddannelse og lokal spredning. Kort sagt er skiver fyldt med billedfarvestoffer og placeres i et billeddannelseskammer, der kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale billeder bruges til at vurdere den oprindelige levedygtighed og cellulære funktionalitet. Denne procedure undersøger også translationel cellulær bevægelse og parakrin signalinteraktion i TME. Endelig beskriver vi en dissociationsprotokol for tumorskiver, der skal bruges til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan anvendes til terapeutisk test fra bænk til seng for at bestemme ændringer, der forekommer i immunlandskabet og epitelcelleindholdet.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjældent syndrom med en forekomst på 1 pr. Million mennesker om året¹. De fleste PMP-tilfælde er forårsaget af metastaser fra appendiceale neoplasmer. I betragtning af at mus ikke har et menneskelignende appendiks, er modellering af denne type kræft fortsat ekstremt udfordrende. Mens den primære sygdom ofte kan helbredes ved kirurgisk resektion, er behandlingsmulighederne for metastatisk sygdom begrænsede. Derfor er begrundelsen for at udvikle denne nye organotypiske skivemodel at studere patobiologien af PMP. Til dato er der ingen appendiceal organoidmodeller, der kan dyrkes evigt; Imidlertid viste en nylig mode....

Deidentifikation og erhvervelse af alt væv blev udført under en IRB-godkendt protokol ved University of California, San Diego.

1. Fremstilling af humant PMP-væv til vævsbehandling og -dyrkning

1. Transport af tumorvæv og mikrodissektion
   1. Forbered transport- og kulturmediet: Udfyld 10% (v / v) Dulbeccos modificerede ørnemedier (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep).
   2. Ved vævets ankomst og i henhold til en institu.......

Kort sagt opnås humane tumorprøver fra PMP under en IRB-godkendt protokol. Vævet fremstilles, mikrodissekeres og størkner i en agaroseform, der skal skæres ved hjælp af et vibratomt (figur 1A; Video 1). Når de er skåret, placeres vævsskiver og dyrkes på permeable indsatsmembraner (figur 1B), som kan bruges til billeddannelsesassays in situ såvel som til cellulære og funktionelle forhør ved hjælp af flowcytometri, konfokal .......

Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har brugt adskillige downstream funktionelle assays til at forhøre tumorimmunmikromiljøet og en platform til bench-to-bedside test.

Mens metoden er yderst effektiv i vores hænder, vil det kræve en vis øvelse at skære tumorprøver ved hjælp af et vibraatom. Vi stødte nemlig på problemer, der skyldtes meget mucinøse prøver, samt prøver, der fej.......

Forfatterne vil gerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kernefacilitet for hjælp med mikroskoperne UCSD Specialized Cancer Support Center P30 tilskud 2P30CA023100. Dette arbejde blev desuden støttet af et JoVE-publikationstilskud (JRW) samt generøse gaver fra boet efter Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).