Cultuur en beeldvorming van ex vivo organotypische pseudomyxoma peritonei tumorplakken van gereseceerde menselijke tumorspecimens

We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzame aandoening die het gevolg is van de verspreiding van een mucineuze primaire tumor en de resulterende accumulatie van mucine-afscheidende tumorcellen in de peritoneale holte. PMP kan voortkomen uit verschillende soorten kanker, waaronder appendiceale, eierstok- en colorectale, hoewel appendiceale neoplasmata veruit de meest voorkomende etiologie zijn. PMP is een uitdaging om te bestuderen vanwege de (1) zeldzaamheid, (2) beperkte muizenmodellen en (3) mucineuze, acellulaire histologie. De hier gepresenteerde methode maakt real-time visualisatie en ondervraging van deze tumortypen mogelijk met behulp van patiënt-afgeleide ex vivo organotypische plakjes in een preparaat waarbij de tumormicro-omgeving (TME) intact blijft. In dit protocol beschrijven we eerst de bereiding van tumorplakken met behulp van een vibratoom en vervolgens een langetermijncultuur. Ten tweede beschrijven we confocale beeldvorming van tumorplakken en hoe functionele uitlezingen van levensvatbaarheid, calciumbeeldvorming en lokale proliferatie kunnen worden gevolgd. Kortom, plakjes worden geladen met beeldvormende kleurstoffen en worden in een beeldvormingskamer geplaatst die op een confocale microscoop kan worden gemonteerd. Time-lapse-video's en confocale afbeeldingen worden gebruikt om de initiële levensvatbaarheid en cellulaire functionaliteit te beoordelen. Deze procedure onderzoekt ook translationele cellulaire beweging en paracriene signaleringsinteracties in de TME. Ten slotte beschrijven we een dissociatieprotocol voor tumorplakken dat moet worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse. Kwantitatieve flowcytometrie-analyse kan worden gebruikt voor bench-to-bedside therapeutische testen om veranderingen te bepalen die optreden in het immuunlandschap en de epitheelcelinhoud.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzaam syndroom met een incidentie van 1 per miljoen mensen per jaar¹. De meeste PMP-gevallen worden veroorzaakt door metastasen van appendiceale neoplasmata. Aangezien muizen geen mensachtige appendix hebben, blijft het modelleren van dit type kanker uiterst uitdagend. Hoewel de primaire ziekte vaak te genezen is door chirurgische resectie, zijn de behandelingsopties voor gemetastaseerde ziekte beperkt. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van dit nieuwe organotypische slice-model het bestuderen van de pathobiologie van PMP. Tot op heden zijn er geen appendiceale organoïde modellen die eeuwigdurend kunn....

De deidentificatie en verwerving van alle weefsels werden uitgevoerd onder een IRB-goedgekeurd protocol aan de Universiteit van Californië, San Diego.

1. Bereiding van menselijke PMP-weefsels voor weefselbewerking en -kweek

1. Transport van tumorweefsels en microdissectie
   1. Bereid de transport- en cultuurmedia voor: voltooi 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 1% Penicilline/Streptomycine (Pen Strep).
   2. Bij aankomst.......

Kortom, menselijke tumormonsters van PMP worden verkregen onder een IRB-goedgekeurd protocol. Het weefsel wordt geprepareerd, micro-ontleed en gestold in een agarose-mal om te worden gesneden met behulp van een vibratoom (figuur 1A; Video 1). Eenmaal gesneden, worden weefselplakken geplaatst en gekweekt op permeabele insertmembranen (figuur 1B), die kunnen worden gebruikt voor beeldvormingstests in situ, evenals voor cellulaire en funct.......

Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt om menselijke pseudomyxoma peritonei (PMP) tumormonsters te kweken, te ondervragen en te analyseren. We hebben talloze downstream functionele assays gebruikt om de tumorimmuunmicro-omgeving te ondervragen en een platform voor bench-to-bedside testen.

Hoewel de methode zeer efficiënt is in onze handen, vereist het enige oefening om tumormonsters te snijden met behulp van een vibratoom. We kwamen namelijk problemen tegen die te wijt.......

De auteurs willen Kersi Pestonjamasp van de Moores Cancer Center imaging core facility bedanken voor hulp bij de microscopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Dit werk werd bovendien ondersteund door een JoVE-publicatiebeurs (JRW), evenals gulle giften uit de nalatenschap van Elisabeth en Ad Creemers, de Euske Family Foundation, het Gastrointestinal Cancer Research Fund en het Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).