Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Le pseudomyxome peritonei (PMP) est une maladie rare qui résulte de la dissémination d’une tumeur primaire mucineuse et de l’accumulation résultante de cellules tumorales sécrétant de la mucine dans la cavité péritonéale. La PMP peut provenir de divers types de cancers, y compris l’appendice, l’ovaire et le colorectal, bien que les néoplasmes de l’appendice soient de loin l’étiologie la plus courante. La PMP est difficile à étudier en raison de (1) sa rareté, (2) ses modèles murins limités et (3) son histologie acellulaire mucineuse. La méthode présentée ici permet de visualiser et d’interroger en temps réel ces types de tumeurs à l’aide de tranches organotypiques ex vivo dérivées du patient dans une préparation où le microenvironnement tumoral (TME) reste intact. Dans ce protocole, nous décrivons d’abord la préparation de tranches tumorales à l’aide d’un vibratome et la culture ultérieure à long terme. Deuxièmement, nous décrivons l’imagerie confocale des tranches tumorales et comment surveiller les lectures fonctionnelles de la viabilité, de l’imagerie calcique et de la prolifération locale. En bref, les tranches sont chargées de colorants d’imagerie et sont placées dans une chambre d’imagerie qui peut être montée sur un microscope confocal. Des vidéos accélérées et des images confocales sont utilisées pour évaluer la viabilité initiale et la fonctionnalité cellulaire. Cette procédure explore également le mouvement cellulaire translationnel et les interactions de signalisation paracrine dans le TME. Enfin, nous décrivons un protocole de dissociation pour les tranches tumorales à utiliser pour l’analyse de cytométrie en flux. L’analyse quantitative par cytométrie en flux peut être utilisée pour les tests thérapeutiques du laboratoire au chevet du patient afin de déterminer les changements qui se produisent dans le paysage immunitaire et le contenu des cellules épithéliales.

Le pseudomyxome péritonique (PMP) est un syndrome rare avec un taux d’incidence de 1 par million de personnes par an¹. La plupart des cas de PMP sont causés par des métastases de néoplasmes appendiceux. Étant donné que les souris n’ont pas d’appendice semblable à celui de l’homme, la modélisation de ce type de cancer reste extrêmement difficile. Bien que la maladie primaire soit souvent curable par résection chirurgicale, les options de traitement de la maladie métastatique sont limitées. Par conséquent, la raison d’être du développement de ce nouveau modèle de tranches organotypiques est d’étudier la pathobiologie de PMP. À ce jour, il n’exist....

La désidentification et l’acquisition de tous les tissus ont été effectuées selon un protocole approuvé par l’IRB à l’Université de Californie à San Diego.

1. Préparation de tissus PMP humains pour le traitement et la culture de tissus

1. Transport des tissus tumoraux et microdissection
   1. Préparer les milieux de transport et de culture : compléter 10 % (v/v) de milieux Eagle modifiés de Dulbecco (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-glutamine, 1 % Pénicilline.......

En bref, les échantillons de tumeurs humaines provenant du PMP sont obtenus dans le cadre d’un protocole approuvé par l’IRB. Le tissu est préparé, microdisséqué et solidifié dans un moule en agarose pour être coupé à l’aide d’un vibratome (figure 1A; Vidéo 1). Une fois coupées, les tranches de tissu sont placées et cultivées sur des membranes d’insertion perméables (Figure 1B), qui peuvent être utilisées pour des essai.......

Ce manuscrit décrit une technique qui peut être utilisée pour cultiver, interroger et analyser des échantillons tumoraux humains de pseudomyxome péritoné (PMP). Nous avons utilisé de nombreux tests fonctionnels en aval pour interroger le microenvironnement immunitaire tumoral et une plate-forme pour les tests du laboratoire au chevet du patient.

Bien que la méthode soit très efficace entre nos mains, il faudra un peu de pratique pour couper des échantillons tumoraux à l’aide d’u.......

Les auteurs tiennent à remercier Kersi Pestonjamasp de l’installation centrale d’imagerie du Moores Cancer Center pour son aide avec les microscopes UCSD Specialized Cancer Support Center P30 subvention 2P30CA023100. Ce travail a également été soutenu par une subvention de publication JoVE (JRW), ainsi que de généreux dons de la succession d’Elisabeth et d’Ad Creemers, de la Fondation de la famille Euske, du Fonds de recherche sur le cancer gastro-intestinal et du Fonds de recherche sur les métastases péritonéales (LAM).