Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung, Kultivierung und Visualisierung von menschlichen Krebserkrankungen, die Metastasen in die Peritonealoberflächen gebildet haben. Resezierte Tumorproben werden mit einem Vibratom geschnitten und auf permeablen Einsätzen kultiviert, um die Sauerstoffversorgung und Viabilität zu erhöhen, gefolgt von Bildgebung und nachgeschalteten Analysen mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie.

Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist eine seltene Erkrankung, die durch die Ausbreitung eines muzinösen Primärtumors und die daraus resultierende Ansammlung von Muzin-sezernierenden Tumorzellen in der Bauchhöhle entsteht. PMP kann durch verschiedene Arten von Krebs entstehen, einschließlich Blinddarmkrebs, Eierstockkrebs und Darmkrebs, obwohl Blinddarmtumoren bei weitem die häufigste Ätiologie sind. PMP ist aufgrund seiner (1) Seltenheit, (2) begrenzten Mausmodellen und (3) muzinöser, azellulärer Histologie schwierig zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung und -Abfrage dieser Tumorarten unter Verwendung von patienteneigenen ex vivo organotypischen Schnitten in einem Präparat, bei dem die Tumormikroumgebung (TME) intakt bleibt. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Präparation von Tumorschnitten mit einem Vibratom und die anschließende Langzeitkultur. Zweitens beschreiben wir die konfokale Bildgebung von Tumorschnitten und wie funktionelle Messwerte der Viabilität, der Kalziumbildgebung und der lokalen Proliferation überwacht werden können. Kurz gesagt, die Schichten werden mit bildgebenden Farbstoffen beladen und in eine Bildgebungskammer gelegt, die auf ein konfokales Mikroskop montiert werden kann. Zeitraffervideos und konfokale Bilder werden verwendet, um die anfängliche Lebensfähigkeit und zelluläre Funktionalität zu beurteilen. Dieses Verfahren untersucht auch die translationale zelluläre Bewegung und parakrine Signalinteraktionen im TME. Abschließend beschreiben wir ein Dissoziationsprotokoll für Tumorschnitte, die für die durchflusszytometrische Analyse verwendet werden sollen. Die quantitative Durchflusszytometrie kann für therapeutische Tests vom Labor bis zum Krankenbett verwendet werden, um Veränderungen innerhalb der Immunlandschaft und des Epithelzellgehalts zu bestimmen.

Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist ein seltenes Syndrom mit einer Inzidenzrate von 1 pro Million Menschen und Jahr¹. Die meisten PMP-Fälle werden durch Metastasen aus Blinddarmneoplasien verursacht. Da Mäuse keinen menschenähnlichen Blinddarm haben, bleibt die Modellierung dieser Krebsart eine große Herausforderung. Während die Grunderkrankung oft durch eine chirurgische Resektion heilbar ist, sind die Behandlungsmöglichkeiten bei metastasierten Erkrankungen begrenzt. Daher ist die Begründung für die Entwicklung dieses neuartigen organotypischen Schnittmodells die Untersuchung der Pathobiologie von PMP. Bis heute gibt es keine Appendiceal-Org....

Die Deidentifizierung und Gewinnung aller Gewebe wurde im Rahmen eines vom IRB genehmigten Protokolls an der University of California, San Diego, durchgeführt.

1. Aufbereitung von humanem PMP-Gewebe für die Gewebeverarbeitung und -kultur

1. Transport von Tumorgewebe und Mikrodissektion
   1. Bereiten Sie die Transport- und Nährmedien vor: Füllen Sie 10 % (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen-Strept.......

Kurz gesagt, menschliche Tumorproben von PMP werden nach einem vom IRB genehmigten Protokoll gewonnen. Das Gewebe wird präpariert, mikropräpariert und in einer Agaroseform verfestigt, um mit einem Vibratom geschnitten zu werden (Abbildung 1A; Video 1). Nach dem Schneiden werden Gewebeschnitte auf permeablen Einlegemembranen platziert und kultiviert (Abbildung 1B), die sowohl für bildgebende Assays in situ als auch für zelluläre und.......

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die zur Kultivierung, Abfrage und Analyse von humanen Pseudomyxoma peritonei (PMP)-Tumorproben verwendet werden kann. Wir haben zahlreiche nachgeschaltete funktionelle Assays verwendet, um die Mikroumgebung des Tumorimmunsystems zu untersuchen, und eine Plattform für Tests vom Labor bis zum Krankenbett.

Während die Methode in unseren Händen sehr effizient ist, erfordert es etwas Übung, Tumorproben mit einem Vibratom zu schneiden. Wir stießen näm.......

Die Autoren bedanken sich bei Kersi Pestonjamasp von der Moores Cancer Center Imaging Core Facility für die Hilfe mit dem UCSD Specialized Cancer Support Center P30 Grant 2P30CA023100. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch ein JoVE-Publikationsstipendium (JRW) sowie großzügige Schenkungen aus dem Nachlass von Elisabeth und Ad Creemers, der Euske Family Foundation, dem Gastrointestinal Cancer Research Fund und dem Peritoneal Metastasis Research Fund (AML) unterstützt.