Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una condizione rara che deriva dalla diffusione di un tumore primario mucinoso e dal conseguente accumulo di cellule tumorali che secernono mucina nella cavità peritoneale. La PMP può derivare da vari tipi di tumori, tra cui appendicolare, ovarico e colon-retto, sebbene le neoplasie appendicolari siano di gran lunga l'eziologia più comune. La PMP è difficile da studiare a causa della sua (1) rarità, (2) modelli murini limitati e (3) istologia mucinosa e acellulare. Il metodo qui presentato consente la visualizzazione e l'interrogazione in tempo reale di questi tipi di tumore utilizzando fette organotipiche ex vivo derivate dal paziente in una preparazione in cui il microambiente tumorale (TME) rimane intatto. In questo protocollo, descriviamo prima la preparazione delle fette tumorali usando un vibratomo e la successiva coltura a lungo termine. In secondo luogo, descriviamo l'imaging confocale delle fette tumorali e come monitorare le letture funzionali della vitalità, l'imaging del calcio e la proliferazione locale. In breve, le fette vengono caricate con coloranti di imaging e vengono poste in una camera di imaging che può essere montata su un microscopio confocale. I video time-lapse e le immagini confocali vengono utilizzati per valutare la fattibilità iniziale e la funzionalità cellulare. Questa procedura esplora anche il movimento cellulare traslazionale e le interazioni di segnalazione paracrina nella TME. Infine, descriviamo un protocollo di dissociazione per fette tumorali da utilizzare per l'analisi della citometria a flusso. L'analisi quantitativa della citometria a flusso può essere utilizzata per test terapeutici da banco a letto per determinare i cambiamenti che si verificano all'interno del panorama immunitario e del contenuto delle cellule epiteliali.

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una sindrome rara con un tasso di incidenza di 1 per milione di persone all'anno¹. La maggior parte dei casi di PMP sono causati da metastasi da neoplasie appendicolari. Dato che i topi non hanno un'appendice simile a quella umana, modellare questo tipo di cancro rimane estremamente impegnativo. Mentre la malattia primaria è spesso curabile con la resezione chirurgica, le opzioni di trattamento per la malattia metastatica sono limitate. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questo nuovo modello di fetta organotipica è quello di studiare la patobiologia della PMP. Ad oggi, non esistono modelli di organoidi a....

La deidentificazione e l'acquisizione di tutti i tessuti sono state eseguite secondo un protocollo approvato dall'IRB presso l'Università della California, San Diego.

1. Preparazione di tessuti PMP umani per la lavorazione e la coltura di tessuti

1. Trasporto di tessuti tumorali e microdissezione
   1. Preparare i terreni di trasporto e coltura: completare il 10% (v/v) di Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, 1% Penicillina/Streptomycin (Pe.......

In breve, i campioni di tumore umano da PMP sono ottenuti secondo un protocollo approvato dall'IRB. Il tessuto viene preparato, micro-sezionato e solidificato in uno stampo di agarosio per essere tagliato usando un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una volta tagliate, le fette di tessuto vengono posizionate e coltivate su membrane di inserto permeabili (Figura 1B), che possono essere utilizzate per saggi di imaging in situ, nonché per in.......

Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per coltivare, interrogare e analizzare campioni di tumore umano di pseudomixoma peritonei (PMP). Abbiamo utilizzato numerosi saggi funzionali a valle per interrogare il microambiente immunitario del tumore e una piattaforma per i test da banco a letto.

Mentre il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, richiederà una certa pratica per tagliare campioni tumorali usando un vibratomo. Vale a dire, abbiamo riscontrato pr.......

Gli autori desiderano ringraziare Kersi Pestonjamasp del Moores Cancer Center imaging core facility per l'aiuto con i microscopi UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Questo lavoro è stato inoltre supportato da una sovvenzione di pubblicazione JoVE (JRW), nonché da generose donazioni dalla tenuta di Elisabeth e Ad Creemers, dalla Euske Family Foundation, dal Gastrointestinal Cancer Research Fund e dal Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).