切除されたヒト腫瘍標本からの ex vivo 器官型偽粘液腫腹膜腫瘍スライスの培養とイメージング

腹膜表面に転移したヒトがんの産生、培養、可視化のためのプロトコルについて説明します。切除した腫瘍標本をビブラトームを使用して切断し、透過性インサートで培養して酸素化と生存率を高めた後、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用したイメージングとダウンストリーム分析を行います。

腹膜偽粘液腫(PMP)は、粘液性原発腫瘍の播種とその結果としての腹腔内のムチン分泌腫瘍細胞の蓄積に起因するまれな状態です。PMPは、虫垂、卵巣、結腸直腸などのさまざまな種類の癌から発生する可能性がありますが、虫垂腫瘍が群を抜いて最も一般的な病因です。PMPは、その(1)希少性、(2)限られたマウスモデル、および(3)粘液性の無細胞組織学のために研究が困難です。ここで紹介する方法は、腫瘍微小環境(TME)が無傷のままである調製物において、患者由来の ex vivo 器官型スライスを使用して、これらの腫瘍タイプのリアルタイムの視覚化および調査を可能にする。このプロトコルでは、まず、ビブラトームを使用した腫瘍スライスの調製とその後の長期培養について説明します。次に、腫瘍スライスの共焦点イメージングと、生存率、カルシウムイメージング、および局所増殖の機能的読み出しを監視する方法について説明します。要するに、スライスにはイメージング色素が装填され、共焦点顕微鏡に取り付けることができるイメージングチャンバーに配置されます。タイムラプスビデオと共焦点画像を使用して、初期の生存率と細胞機能を評価します。この手順では、TMEにおける翻訳細胞運動、およびパラクリンシグナル伝達相互作用についても調べます。最後に、フローサイトメトリー分析に使用する腫瘍スライスの解離プロトコルについて説明します。定量的フローサイトメトリー分析は、ベンチからベッドサイドまでの治療試験に使用でき、免疫ランドスケープと上皮細胞含有量内で発生する変化を判断できます。

腹膜偽粘液腫(PMP)はまれな症候群で、発生率は年間100万人あたり1人です¹。ほとんどのPMP症例は虫垂腫瘍からの転移によって引き起こされます。マウスには人間のような虫垂がないことを考えると、このタイプの癌のモデル化は依然として非常に困難です。原発性疾患は外科的切除によって治癒することが多いが、転移性疾患の治療選択肢は限られている。したがって、この新しい有機型スライスモデルを開発する理論的根拠は、PMPの病理生物学を研究することです。現在まで、永久培養できる虫垂オルガノイドモデルはありません。しかし、最近のモデルは、治療薬の薬理学的試験および免疫療法に有用であることが示された²。そのため、脳、乳がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がんなど、他の種類のヒトがんで使用されている有機型スライス培養システムを適応させました^3,4,5,6。

虫垂腫瘍に加えて、PMPは時折、卵巣癌⁷、まれに膝管内乳頭粘液性腫瘍⁸および結腸癌

すべての組織の非同定と取得は、カリフォルニア大学サンディエゴ校でIRB承認プロトコルの下で実施されました。

1.組織処理および培養のためのヒトPMP組織の調製

1. 腫瘍組織の輸送と微小解剖
   1. 輸送および培養培地の準備:10%(v/v)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%FBS、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペンストレプトレプ)を完.......

要するに、PMPからのヒト腫瘍標本は、IRB承認プロトコルの下で取得されます。組織を調製し、微小解剖し、アガロース型で固化させ、ビブラトームを使用して切断する(図1A;ビデオ1)。切断された組織スライスは、透過性インサートメンブレン上に置かれて培養され(図1B)、in situでのイメージングアッセイ、フローサイトメトリー.......

この原稿では、ヒト腹膜偽粘液腫(PMP)腫瘍標本の培養、尋問、分析に使用できる技術について説明しています。私たちは、腫瘍免疫微小環境を調べるために多数のダウンストリーム機能アッセイと、ベンチからベッドサイドまでのテストのためのプラットフォームを利用しました。

この方法は私たちの手の中で非常に効率的ですが、ビブラトームを使用して腫瘍標本を切.......

著者らは、顕微鏡UCSD専門がんサポートセンターP30助成金2P30CA023100を支援してくれたムーアがんセンターのイメージングコア施設のKersi Pestonjamaspに感謝したいと思います。この研究は、JoVE出版助成金(JRW)と、エリザベスとアドクリーマーズの財産、ユースケ家族財団、消化器がん研究基金、腹膜転移研究基金(AML)からの寛大な贈り物によってさらに支援されました。