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Cancer Research

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

Published: December 9th, 2022

DOI:

10.3791/64620

1Department of Surgery, University of California

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

가성 점액종 복막종(PMP)은 점액성 원발성 종양의 파종과 그에 따른 복강 내 점액 분비 종양 세포의 축적으로 인해 발생하는 드문 질환입니다. PMP는 맹장암, 난소암, 결장직장암을 포함한 다양한 유형의 암에서 발생할 수 있지만 맹장 신생물이 단연코 가장 흔한 병인입니다. PMP는 (1) 희귀성, (2) 제한된 쥐 모델 및 (3) 점액성, 무세포 조직학으로 인해 연구하기 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 종양 미세 환경(TME)이 손상되지 않은 제제에서 환자 유래 생체 외 기관형 슬라이스를 사용하여 이러한 종양 유형을 실시간으로 시각화하고 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 비브라톰을 사용하여 종양 절편을 준비하고 후속 장기 배양을 설명합니다. 둘째, 종양 절편의 컨포칼 이미징과 생존력, 칼슘 이미징 및 국소 증식의 기능적 판독값을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 요컨대, 슬라이스에는 이미징 염료가 로드되고 컨포칼 현미경에 장착할 수 있는 이미징 챔버에 배치됩니다. 타임랩스 비디오와 컨포칼 이미지는 초기 생존력과 세포 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 이 절차는 또한 TME에서 번역 세포 이동 및 측분비 신호 상호작용을 탐구합니다. 마지막으로, 유세포 분석에 사용되는 종양 절편에 대한 해리 프로토콜을 설명합니다. 정량적 유세포 분석은 면역 환경 및 상피 세포 함량 내에서 발생하는 변화를 확인하기 위해 벤치 투 베드사이드 치료 테스트에 사용할 수 있습니다.

복막가점액종(PMP)은 연간 발병률이 100만 명당 1명인 희귀 증후군입니다1. 대부분의 PMP 사례는 맹장 신생물의 전이로 인해 발생합니다. 생쥐가 인간과 같은 맹장을 가지고 있지 않다는 점을 감안할 때, 이러한 유형의 암을 모델링하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 원발성 질환은 종종 외과적 절제로 치료할 수 있지만 전이성 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. 따라서 이 새로운 기관형 절편 모델을 개발하는 근거는 PMP의 병리학을 연구하는 것입니다. 현재까지 영구적으로 배양할 수 있는 맹장 오가노이드 모델은 없습니다. 그러나, 최근의 모델은 치료제 및 면역요법의 약리학적 시험에 유용한 것으로 나타났다2. 따라서 우리는 뇌암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암 등과 같은 다른 유형의 인간 암에 사용된 기관형 절편 배양 시스템을 채택했습니다 3,4,5,6.

맹장 신생물 외에도 PMP는 난소암7....

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모든 조직의 비식별화 및 획득은 샌디에이고 캘리포니아 대학교에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 가공 및 배양을 위한 인간 PMP 조직의 제조

  1. 종양 조직의 운반 및 미세 해부
    1. 수송 및 배양 배지 준비: 10%(v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM), 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen Strep)을 완료합니다.
    2. 조직 도착 시.......

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요컨대, PMP의 인간 종양 표본은 IRB 승인 프로토콜에 따라 얻어집니다. 조직을 준비하고, 미세 해부하고, 비브라톰을 사용하여 절단할 아가로스 주형에서 고형화한다(도 1A; 비디오 1). 절단된 조직 절편은 투과성 삽입막(그림 1B)에 배치되고 배양되며, 이는 현장 이미징 분석뿐만 아니라 유세포 분석, 컨포칼 이미징 분석 및 세포 독성 ?.......

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이 원고는 인간 가성 점액종 복막종(PMP) 종양 표본을 배양, 심문 및 분석하는 데 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 종양 면역 미세 환경과 벤치 투 베드사이드 테스트를 위한 플랫폼을 조사하기 위해 수많은 다운스트림 기능 분석을 활용했습니다.

이 방법은 우리 손에서 매우 효율적이지만 비브라톰을 사용하여 종양 표본을 절단하는 데는 약간의 연습이 필요합니다. .......

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저자는 현미경 UCSD 전문 암 지원 센터 P30 보조금 2P30CA023100에 도움을 준 Moores Cancer Center 이미징 핵심 시설의 Kersi Pestonjamasp에게 감사를 표합니다. 이 작업은 JoVE 출판 보조금(JRW)과 Elisabeth 및 Ad Creemers의 유산, Euske 가족 재단, 위장암 연구 기금 및 복막 전이 연구 기금(AML)의 관대한 선물로 추가로 지원되었습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M HEPES solutionSigmaH0887
1 M MgCl2 solution SigmaM1028
100 micron filterThermoFisher22-363-549
22 x 40 glass coverslipsDaiggerbrandG15972H
3 M KCl solutionSigma60135
5 M NaCl solutionSigmaS5150
ATPγS Tocris 4080
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
Calcein-AM InvitrogenL3224
CD11b Biolegend101228
CD206 Biolegend321140
CD3Biolegend555333
CD4 Biolegend357410
CD45 Biolegend304006
CD8 Biolegend344721
CellTiter-Glo PromegaG9681
DMEM Thermo Fisher11965084
DPBS Sigma AldrichD8537
FBS, heat inactivatedThermoFisher16140071
Fc-block BD Biosciences564220
Fluo-4Thermo FisherF14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase Stem Cell7912
Imaging ChamberWarner InstrumentsRC-26
Imaging Chamber PlatformWarner InstrumentsPH-1
LD-Blue BiolegendL23105
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
LIVE/DEAD imaging dyesThermofisherR37601
Nikon Ti microscope NikonIncludes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. 
Peristaltic pump IsamtecISM832C
Propidium IodideInvitrogenL3224
Vacuum silicone greaseSigmaZ273554-1EA

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