Kultur og avbildning av Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Skiver fra resected Human Tumor Specimens

Vi beskriver en protokoll for produksjon, kultur og visualisering av humane kreftformer, som har metastasert til peritoneale overflater. Resekterte tumorprøver kuttes ved hjelp av en vibratome og dyrkes på permeable innlegg for økt oksygenering og levedyktighet, etterfulgt av avbildning og nedstrømsanalyser ved hjelp av konfokalmikroskopi og flowcytometri.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjelden tilstand som skyldes spredning av en mucinøs primærtumor og den resulterende akkumuleringen av mucinutskillende tumorceller i bukhulen. PMP kan oppstå fra ulike typer kreftformer, inkludert blindtarm, eggstokk og kolorektal, selv om appendikeale neoplasmer er langt den vanligste etiologien. PMP er utfordrende å studere på grunn av sin (1) sjeldenhet, (2) begrensede murine modeller, og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden som presenteres her tillater sanntidsvisualisering og undersøkelse av disse tumortypene ved bruk av pasientavledede ex vivo organotypiske skiver i et preparat der tumormikromiljøet (TME) forblir intakt. I denne protokollen beskriver vi først fremstilling av tumorskiver ved hjelp av en vibratomi og påfølgende langtidskultur. For det andre beskriver vi konfokal avbildning av tumorskiver og hvordan man overvåker funksjonelle avlesninger av levedyktighet, kalsiumavbildning og lokal spredning. Kort sagt, skiver er lastet med bildebehandlingsfarger og plasseres i et bildekammer som kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale bilder brukes til å vurdere den opprinnelige levedyktigheten og cellulær funksjonalitet. Denne prosedyren utforsker også translasjonell cellulær bevegelse og parakrine signaleringsinteraksjoner i TME. Til slutt beskriver vi en dissosiasjonsprotokoll for tumorskiver som skal brukes til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan brukes til benk-til-seng-terapeutisk testing for å bestemme endringer som skjer i immunlandskapet og epitelcelleinnhold.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjeldent syndrom med en forekomst på 1 per million mennesker per år¹. De fleste PMP-tilfeller skyldes metastaser fra appendikeale svulster. Gitt at mus ikke har en menneskelignende blindtarm, er modellering av denne typen kreft fortsatt ekstremt utfordrende. Mens den primære sykdommen ofte kan kureres ved kirurgisk reseksjon, er behandlingsmuligheter for metastatisk sykdom begrenset. Derfor er begrunnelsen for å utvikle denne nye organotypiske skivemodellen å studere patobiologien til PMP. Til dags dato er det ingen appendikale organoidmodeller som kan dyrkes evig; Imidlertid ble en nylig modell vist å være nytti....

Avidentifisering og oppkjøp av alle vev ble utført under en IRB-godkjent protokoll ved University of California, San Diego.

1. Fremstilling av humant PMP-vev for vevsbehandling og kultur

1. Transport av tumorvev og mikrodisseksjon
   1. Forbered transport- og kulturmediet: fullfør 10% (v / v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen streptokokker).
   2. Ved vevsankomst og i henhold til en institusjonel.......

Kort sagt, humane tumorprøver fra PMP oppnås under en IRB-godkjent protokoll. Vevet fremstilles, mikrodissekeres og størknes i en agaroseform som skal kuttes ved hjelp av en vibratome (figur 1A; Video 1). Etter kutt plasseres vevsskiver og dyrkes på permeable innsatsmembraner (figur 1B), som kan brukes til avbildningsanalyser in situ, samt til cellulær og funksjonell avhør ved hjelp av flowcytometri, konfokal bildeanalyse og cytot.......

Dette manuskriptet beskriver en teknikk som kan brukes til å dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har benyttet mange nedstrøms funksjonelle analyser for å forhøre tumorimmunmikromiljøet og en plattform for benk-til-senge-testing.

Selv om metoden er svært effektiv i våre hender, vil det kreve litt øvelse å kutte tumorprøver ved hjelp av en vibratom. Vi opplevde nemlig problemer som skyldtes svært mucinøse prøver, samt prøver som feilakt.......

Forfatterne vil gjerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kjerneanlegg for hjelp med mikroskopene UCSD Specialized Cancer Support Center P30 stipend 2P30CA023100. Dette arbeidet ble i tillegg støttet av et JoVE-publikasjonsstipend (JRW), samt sjenerøse gaver fra boet til Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).