Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma condição rara que resulta da disseminação de um tumor primário mucinoso e do consequente acúmulo de células tumorais secretoras de mucina na cavidade peritoneal. A PMF pode surgir de vários tipos de cânceres, incluindo apendicular, ovariano e colorretal, embora as neoplasias do apêndice sejam de longe a etiologia mais comum. O PMP é desafiador de estudar devido à sua (1) raridade, (2) modelos murinos limitados e (3) histologia mucinosa e acelular. O método aqui apresentado permite a visualização e interrogação em tempo real desses tipos tumorais utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados do paciente em uma preparação onde o microambiente tumoral (TME) permanece intacto. Neste protocolo, primeiramente descrevemos o preparo de fatias tumorais utilizando um vibratomo e posterior cultura a longo prazo. Em segundo lugar, descrevemos imagens confocais de cortes tumorais e como monitorar leituras funcionais de viabilidade, imagens de cálcio e proliferação local. Em suma, as fatias são carregadas com corantes de imagem e são colocadas em uma câmara de imagem que pode ser montada em um microscópio confocal. Vídeos com lapso de tempo e imagens confocais são usados para avaliar a viabilidade inicial e a funcionalidade celular. Este procedimento também explora o movimento celular translacional e as interações de sinalização parácrina na EMT. Por fim, descrevemos um protocolo de dissociação de cortes tumorais a serem utilizados para análise por citometria de fluxo. A análise quantitativa por citometria de fluxo pode ser usada para testes terapêuticos de bancada para leito para determinar as mudanças que ocorrem na paisagem imune e no conteúdo das células epiteliais.

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma síndrome rara, com incidência de 1 por milhão de pessoas por^ano1. A maioria dos casos de PMF é causada por metástases de neoplasias do apêndice. Dado que os ratos não têm um apêndice semelhante ao humano, modelar este tipo de cancro continua a ser extremamente desafiante. Embora a doença primária seja frequentemente curável por ressecção cirúrgica, as opções de tratamento para doença metastática são limitadas. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento deste novo modelo de fatiamento organotípico é estudar a patobiologia da PMP. Até o momento, não existem modelos organoides apendiculares que possam se....

A desidentificação e aquisição de todos os tecidos foram realizadas sob um protocolo aprovado pelo IRB na Universidade da Califórnia, San Diego.

1. Preparação de tecidos humanos de PMP para processamento e cultura de tecidos

1. Transporte de tecidos tumorais e microdissecção
   1. Preparar os meios de transporte e cultura: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamina, 1% Penicilina/Streptomicina (Pen Strep).
   2. .......

Em suma, espécimes tumorais humanos de PMP são obtidos sob um protocolo aprovado pelo IRB. O tecido é preparado, microdissecado e solidificado em molde de agarose para ser cortado com vibratomo (Figura 1A; Vídeo 1). Uma vez cortados, os cortes de tecido são colocados e cultivados em membranas de inserção permeável (Figura 1B), que podem ser utilizadas para exames de imagem in situ, bem como para interrogação celular e funciona.......

Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para cultura, interrogação e análise de espécimes tumorais de pseudomixoma peritoneal humano (PMP). Utilizamos numerosos ensaios funcionais a jusante para interrogar o microambiente imune do tumor e uma plataforma para testes de bancada para leito.

Embora o método seja altamente eficiente em nossas mãos, será necessária alguma prática para cortar espécimes tumorais usando um vibratome. Ou seja, encontramos problemas que foram d.......

Os autores gostariam de agradecer a Kersi Pestonjamasp da instalação do núcleo de imagem do Moores Cancer Center pela ajuda com os microscópios UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Este trabalho foi adicionalmente apoiado por uma bolsa de publicação JoVE (JRW), bem como generosos presentes do espólio de Elisabeth e Ad Creemers, da Euske Family Foundation, do Gastrointestinal Cancer Research Fund e do Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).