Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год¹. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, ко....

Деидентификация и приобретение всех тканей были выполнены в соответствии с протоколом, одобренным IRB в Калифорнийском университете в Сан-Диего.

1. Подготовка тканей ПМП человека к тканевой обработке и культивированию

1. Транспорт опухолевых тканей и микроди?.......

Короче говоря, образцы опухолей человека из PMP получают в соответствии с протоколом, одобренным IRB. Ткань подготавливают, микропрепарируют и затвердевают в агарозной форме для разрезания с помощью вибратома (рис. 1А; Видео 1). После разрезания срезы ткани помещаю?.......

В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу .......

Авторы хотели бы поблагодарить Керси Пестонджамасп из центра визуализации Онкологического центра Мура за помощь с микроскопами UCSD Специализированный центр поддержки рака P30 грант 2P30CA023100. Эта работа была дополнительно поддержана грантом на публикацию JoVE (JRW), а также щедрыми подарками от поместья Элизабет и Эд Кримерс, Фонда семьи Юске, Фонда исследований рака желудочно-кишечного тракта и Фонда исследований метастазов в брюшной полости (AML).