Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

El pseudomixoma peritonei (PMP) es una afección poco frecuente que resulta de la diseminación de un tumor primario mucinoso y la acumulación resultante de células tumorales secretoras de mucina en la cavidad peritoneal. La PMP puede surgir de varios tipos de cáncer, incluidos el apendicular, el ovárico y el colorrectal, aunque las neoplasias apendiculares son, con mucho, la etiología más común. La PMP es difícil de estudiar debido a su (1) rareza, (2) modelos murinos limitados y (3) histología mucinosa y acelular. El método presentado aquí permite la visualización e interrogación en tiempo real de estos tipos de tumores utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados del paciente en una preparación donde el microambiente tumoral (TME) permanece intacto. En este protocolo, primero describimos la preparación de cortes tumorales utilizando un vibratomo y el posterior cultivo a largo plazo. En segundo lugar, describimos imágenes confocales de cortes tumorales y cómo monitorear las lecturas funcionales de viabilidad, imágenes de calcio y proliferación local. En resumen, las rebanadas se cargan con tintes de imagen y se colocan en una cámara de imágenes que se puede montar en un microscopio confocal. Los videos de lapso de tiempo y las imágenes confocales se utilizan para evaluar la viabilidad inicial y la funcionalidad celular. Este procedimiento también explora el movimiento celular traslacional y las interacciones de señalización paracrina en el TME. Por último, describimos un protocolo de disociación para cortes tumorales que se utilizarán para el análisis de citometría de flujo. El análisis cuantitativo de citometría de flujo se puede utilizar para pruebas terapéuticas de banco a cabecera para determinar los cambios que ocurren dentro del paisaje inmune y el contenido de células epiteliales.

El pseudomixoma peritonei (PMP) es un síndrome raro con una tasa de incidencia de 1 por millón de personas por año¹. La mayoría de los casos de PMP son causados por metástasis de neoplasias apendiculares. Dado que los ratones no tienen un apéndice similar al humano, modelar este tipo de cáncer sigue siendo extremadamente desafiante. Si bien la enfermedad primaria a menudo se puede curar mediante resección quirúrgica, las opciones de tratamiento para la enfermedad metastásica son limitadas. Por lo tanto, la razón para desarrollar este nuevo modelo de corte organotípico es estudiar la patobiología de PMP. Hasta la fecha, no hay modelos organoides....

La desidentificación y adquisición de todos los tejidos se realizó bajo un protocolo aprobado por el IRB en la Universidad de California, San Diego.

1. Preparación de tejidos PMP humanos para procesamiento y cultivo de tejidos

1. Transporte de tejidos tumorales y microdisección
   1. Preparar los medios de transporte y cultivo: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1% Penicilina/Estreptomicina (Pen Strep).

En resumen, las muestras de tumores humanos de PMP se obtienen bajo un protocolo aprobado por el IRB. El tejido se prepara, se microdisecciona y se solidifica en un molde de agarosa para ser cortado con un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una vez cortados, los cortes de tejido se colocan y se cultivan en membranas de inserción permeables (Figura 1B), que se pueden utilizar para ensayos de imágenes in situ, así como para interrogación.......

Este manuscrito describe una técnica que se puede utilizar para cultivar, interrogar y analizar muestras tumorales de pseudomixoma peritonei humano (PMP). Hemos utilizado numerosos ensayos funcionales posteriores para interrogar el microambiente inmune del tumor y una plataforma para pruebas de banco a cabecera.

Si bien el método es altamente eficiente en nuestras manos, requerirá algo de práctica para cortar muestras tumorales usando un vibratomo. Es decir, encontramos problemas que se de.......

Los autores desean agradecer a Kersi Pestonjamasp del centro central de imágenes del Moores Cancer Center por su ayuda con la subvención 2P30CA023100 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer P30 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer de UCSD con los microscopios. Este trabajo fue apoyado adicionalmente por una subvención de publicación JoVE (JRW), así como generosas donaciones del patrimonio de Elisabeth y Ad Creemers, la Fundación de la Familia Euske, el Fondo de Investigación del Cáncer Gastrointestinal y el Fondo de Investigación de Metástasis Peritoneal (AML).