Odling och avbildning av ex vivo organotypiska pseudomyxoma peritonei tumörskivor från resekterade humana tumörprover

Vi beskriver ett protokoll för produktion, odling och visualisering av mänskliga cancerformer, som har metastaserat till peritoneala ytor. Resekterade tumörprover skärs med hjälp av en vibratom och odlas på permeabla insatser för ökad syresättning och livskraft, följt av avbildning och nedströmsanalyser med konfokalmikroskopi och flödescytometri.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är ett sällsynt tillstånd som härrör från spridningen av en mucinös primärtumör och den resulterande ackumuleringen av mucinutsöndrande tumörceller i bukhålan. PMP kan uppstå från olika typer av cancer, inklusive appendiceal, ovarian och kolorektal, även om appendiceal neoplasmer är den överlägset vanligaste etiologin. PMP är utmanande att studera på grund av dess (1) sällsynthet, (2) begränsade murina modeller och (3) mucinös, acellulär histologi. Metoden som presenteras här möjliggör visualisering och förhör i realtid av dessa tumörtyper med hjälp av patienthärledda ex vivo organotypiska skivor i ett preparat där tumörmikromiljön (TME) förblir intakt. I detta protokoll beskriver vi först beredningen av tumörskivor med användning av en vibratom och efterföljande långsiktig kultur. För det andra beskriver vi konfokal avbildning av tumörskivor och hur man övervakar funktionella avläsningar av livskraft, kalciumavbildning och lokal spridning. Kort sagt, skivor laddas med bildfärger och placeras i en bildkammare som kan monteras på ett konfokalmikroskop. Timelapse-videor och konfokala bilder används för att bedöma den ursprungliga livskraften och cellulära funktioner. Denna procedur undersöker också translationella cellulära rörelser och parakrina signalinteraktioner i TME. Slutligen beskriver vi ett dissociationsprotokoll för tumörskivor som ska användas för flödescytometrianalys. Kvantitativ flödescytometrianalys kan användas för terapeutisk testning från bänk till säng för att bestämma förändringar som sker inom immunlandskapet och epitelcellinnehållet.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är sällsynt syndrom med en incidens på 1 per miljon människor per år¹. De flesta PMP-fall orsakas av metastaser från appendiceala neoplasmer. Med tanke på att möss inte har en människoliknande bilaga är modellering av denna typ av cancer fortfarande extremt utmanande. Medan den primära sjukdomen ofta kan botas genom kirurgisk resektion, är behandlingsalternativen för metastatisk sjukdom begränsade. Därför är motiveringen för att utveckla denna nya organotypiska skivmodell att studera patobiologin hos PMP. Hittills finns det inga appendiceala organoidmodeller som kan odlas ständigt; En ny modell visade sig dock vara ....

Avidentifiering och förvärv av alla vävnader utfördes enligt ett IRB-godkänt protokoll vid University of California, San Diego.

1. Beredning av humana PMP-vävnader för vävnadsbearbetning och odling

1. Transport av tumörvävnader och mikrodissektion
   1. Förbered transport- och odlingsmedia: komplett 10% (v / v) Dulbeccos modifierade örnmedia (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep).
   2. Vid vävnadens ankomst och enl.......

Kort sagt, humana tumörprover från PMP erhålls under ett IRB-godkänt protokoll. Vävnaden bereds, mikrodissekeras och stelnar i en agarosform för att skäras med hjälp av en vibratom (figur 1A; Videoklipp 1). När vävnadsskivorna har skurits placeras de och odlas på permeabla insatsmembran (figur 1B), som kan användas för avbildningsanalyser in situ, såväl som för cellulära och funktionella förhör med flödescytometri, k.......

Detta manuskript beskriver en teknik som kan användas för att odla, förhöra och analysera humana pseudomyxoma peritonei (PMP) tumörprover. Vi har använt många nedströms funktionella analyser för att förhöra tumörens immunmikromiljö och en plattform för bänk-till-säng-testning.

Medan metoden är mycket effektiv i våra händer, kommer det att kräva viss övning att skära tumörprover med hjälp av en vibratom. Vi stötte nämligen på problem som berodde på mycket mucinösa p.......

Författarna vill tacka Kersi Pestonjamasp från Moores Cancer Center imaging core facility för hjälp med mikroskopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Detta arbete stöddes dessutom av ett JoVE-publikationsbidrag (JRW), samt generösa gåvor från dödsboet efter Elisabeth och Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund och Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).