Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.

Psödomiksoma peritonei (PMP), müsinöz primer tümörün yayılması ve bunun sonucunda periton boşluğunda müsin salgılayan tümör hücrelerinin birikmesi sonucu ortaya çıkan nadir bir durumdur. PMP, apendiks, yumurtalık ve kolorektal dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden kaynaklanabilir, ancak apendiks neoplazmları en yaygın etiyolojidir. PMP'nin (1) nadirliği, (2) sınırlı murin modelleri ve (3) müsinöz, asellüler histolojisi nedeniyle incelenmesi zordur. Burada sunulan yöntem, tümör mikroçevresinin (TME) bozulmadan kaldığı bir preparatta hasta kaynaklı ex vivo organotipik dilimler kullanılarak bu tümör tiplerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve sorgulanmasına izin verir. Bu protokolde, ilk önce bir vibratom ve ardından uzun süreli kültür kullanarak tümör dilimlerinin hazırlanmasını tarif ediyoruz. İkincisi, tümör dilimlerinin konfokal görüntülemesini ve canlılık, kalsiyum görüntüleme ve lokal proliferasyonun fonksiyonel okumalarının nasıl izleneceğini açıklıyoruz. Kısacası, dilimler görüntüleme boyaları ile yüklenir ve konfokal mikroskop üzerine monte edilebilen bir görüntüleme odasına yerleştirilir. Hızlandırılmış videolar ve konfokal görüntüler, ilk canlılığı ve hücresel işlevselliği değerlendirmek için kullanılır. Bu prosedür aynı zamanda TME'deki translasyonel hücresel hareketi ve parakrin sinyal etkileşimlerini de araştırır. Son olarak, akış sitometri analizi için kullanılacak tümör dilimleri için bir ayrışma protokolünü tanımladık. Kantitatif akış sitometri analizi, bağışıklık manzarasında ve epitel hücre içeriğinde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için tezgahtan başucuna terapötik testler için kullanılabilir.

Psödomiksoma peritonei (PMP^{), yılda 1} milyon kişi başına 1 insidans oranı ile nadir görülen bir sendromdur. PMP vakalarının çoğu apendiks neoplazmlarından metastazlardan kaynaklanır. Farelerin insan benzeri bir eki olmadığı göz önüne alındığında, bu tür kanserlerin modellenmesi son derece zor olmaya devam etmektedir. Primer hastalık sıklıkla cerrahi rezeksiyon ile tedavi edilebilirken, metastatik hastalık için tedavi seçenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, bu yeni organotipik dilim modelini geliştirmenin mantığı, PMP'nin patobiyolojisini incelemektir. Bugüne kadar, sürekli olarak kültürlenebilecek apendiks organoid modelleri yoktur; Bununla birlikt....

Tüm dokuların tanımlanması ve edinilmesi, San Diego'daki Kaliforniya Üniversitesi'nde IRB onaylı bir protokol kapsamında gerçekleştirildi.

1. Doku işleme ve kültür için insan PMP dokularının hazırlanması

1. Tümör dokularının taşınması ve mikrodiseksiyon
   1. Taşıma ve kültür ortamını hazırlayın: %10 (v/v) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), %10 FBS, 2 mM L-Glutamin, %1 Penisilin/Streptomisin (Pen Strep) ile tamamlayın.
   .......

Kısacası, PMP'den insan tümör örnekleri IRB onaylı bir protokol altında elde edilir. Doku hazırlanır, mikro-disseke edilir ve bir vibratom kullanılarak kesilmek üzere bir agaroz kalıbında katılaşır (Şekil 1A; Video 1). Kesildikten sonra, doku dilimleri geçirgen uç membranlara yerleştirilir ve kültürlenir (Şekil 1B), bu da in situ görüntüleme tahlillerinin yanı sıra akış sitometrisi, konfokal görüntüleme analizi v.......

Bu makalede, insan psödomiksoma peritonei (PMP) tümör örneklerini kültürlemek, sorgulamak ve analiz etmek için kullanılabilecek bir teknik açıklanmaktadır. Tümör immün mikro çevresini sorgulamak için çok sayıda aşağı akış fonksiyonel tahlili ve tezgahtan başucu testi için bir platform kullandık.

Yöntem ellerimizde oldukça verimli olsa da, bir vibratom kullanarak tümör örneklerini kesmek için biraz pratik gerektirecektir. Yani, yüksek derecede müsinöz örnekle.......

Yazarlar, UCSD İhtisas Kanser Destek Merkezi P30 hibesi 2P30CA023100 mikroskoplarıyla ilgili yardım için Moores Kanser Merkezi görüntüleme çekirdek tesisinden Kersi Pestonjamasp'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ayrıca bir JoVE yayın hibesi (JRW) ve Elisabeth ve Ad Creemers, Euske Aile Vakfı, Gastrointestinal Kanser Araştırma Fonu ve Peritoneal Metastaz Araştırma Fonu (AML) mülklerinden cömert hediyeler ile desteklenmiştir.