In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca² + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca²⁺ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

Ca²⁺ beeldvorming kan worden gebruikt als een proxy voor cellulaire activiteit, inclusief actiepotentialen en verschillende signaleringsmechanismen waarbij Ca 2+ het cytoplasma binnendringt of intracellulaire Ca²⁺ winkels vrijkomt. Pirt-GCaMP3-gebaseerde Ca²⁺ beeldvorming van primaire sensorische neuronen van het dorsale wortelganglion (DRG) bij muizen biedt het voordeel van gelijktijdige meting van een groot aantal cellen. Tot 1.800 neuronen kunnen worden gemonitord, waardoor neuronale netwerken en somatosensorische processen als een ensemble in hun normale fysiologische context op populatieniveau in vivo kunnen worden bestudeerd. Het grote aantal bewaakte neuronen maakt de detectie mogelijk van activiteitspatronen die moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van andere methoden. Stimuli kunnen worden toegepast op de achterpoot van de muis, waardoor de directe effecten van stimuli op het DRG-neuronensemble kunnen worden bestudeerd. Het aantal neuronen dat Ca 2+ transiënten produceert en de amplitude van Ca²⁺ transiënten duidt op gevoeligheid voor specifieke sensorische modaliteiten. De diameter van neuronen levert bewijs van geactiveerde vezeltypen (niet-schadelijke mechano versus schadelijke pijnvezels, Aβ-, Aδ- en C-vezels). Neuronen die specifieke receptoren tot expressie brengen, kunnen genetisch worden gelabeld met td-Tomaat en specifieke Cre-recombinasen samen met Pirt-GCaMP. Daarom biedt Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ beeldvorming van DRG een krachtig hulpmiddel en model voor de analyse van specifieke sensorische modaliteiten en neuronsubtypen die fungeren als een ensemble op populatieniveau om pijn, jeuk, aanraking en andere somatosensorische signalen te bestuderen.

Primaire sensorische neuronen innerveren direct de huid en dragen somatosensorische informatie terug naar het centrale zenuwstelsel ^1,2. Dorsale wortelganglia (DRG's) zijn cellichaamclusters van 10.000-15.000 primaire sensorische neuronen ^3,4. DRG-neuronen vertonen verschillende grootte, myelinisatieniveaus en gen- en receptorexpressiepatronen. Neuronen met een kleinere diameter omvatten pijngevoelige neuronen en neuronen met een grotere diameter reageren meestal op niet-pijnlijke mechanische stimuli ^5,6

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas Health Science Center in San Antonio.

OPMERKING: Eenmaal gestart, moeten dierchirurgie (stap 1) en beeldvorming (stap 2) op een continue manier worden voltooid. Data-analyse (stap 3) kan later worden uitgevoerd.

1. Chirurgie en het beveiligen van het dier voor de rechterkant L5.......

Figuur 4: Representatieve beelden van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen. (A,D) Single frame hoge resolutie scans van L5 dorsale wortelganglia van Pirt-GCaMP3 muizen worden getoond. (B,E) . Gemiddelde intensiteitsprojecties van 15 frames Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglia van respectievelijk pa.......

Aanhoudende pijn is aanwezig in een breed scala van aandoeningen, slopende en / of het verminderen van de kwaliteit van leven voor ongeveer 8% van de mensen²⁹. Primaire sensorische neuronen detecteren schadelijke stimuli op de huid en hun plasticiteit draagt bij aan aanhoudende pijn⁸. Hoewel neuronen kunnen worden bestudeerd in celkweek en explantaten, verwijdert dit ze uit hun normale fysiologische context. Chirurgische blootstelling van de DRG, gevolgd door Pirt-GCaMP3 Ca.......

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01DE026677 en R01DE031477 (aan Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.), en een Rising STAR Award van het University of Texas system (Y.S.K.).