In vivo Imagerie calcique d’ensembles neuronaux dans des réseaux de neurones sensoriels primaires dans des ganglions radiculaires dorsaux intacts

Ce protocole décrit l’exposition chirurgicale du ganglion radiculaire dorsal (DRG) suivi de GCaMP3 (indicateur Ca²⁺ codé génétiquement; Protéine fluorescente verte-calmoduline-protéine M13 3) Imagerie Ca²⁺ des ensembles neuronaux à l’aide de souris Pirt-GCaMP3 tout en appliquant une variété de stimuli à la patte postérieure ipsilatérale.

L’imagerie Ca 2+ peut être utilisée comme proxy de l’activité cellulaire, y compris les potentiels d’action et divers mécanismes de signalisation impliquant l’entrée de Ca 2+ dans le cytoplasme ou la libération de réserves intracellulaires de Ca²⁺. L’imagerie Ca²⁺ basée sur Pirt-GCaMP3 des neurones sensoriels primaires du ganglion de la racine dorsale (DRG) chez la souris offre l’avantage de mesurer simultanément un grand nombre de cellules. Jusqu’à 1 800 neurones peuvent être surveillés, ce qui permet d’étudier les réseaux neuronaux et les processus somatosensoriels en tant qu’ensemble dans leur contexte physiologique normal au niveau de la population in vivo. Le grand nombre de neurones surveillés permet de détecter des schémas d’activité qui seraient difficiles à détecter en utilisant d’autres méthodes. Les stimuli peuvent être appliqués à la patte postérieure de la souris, ce qui permet d’étudier les effets directs des stimuli sur l’ensemble neuronal DRG. Le nombre de neurones produisant des transitoires Ca 2+ ainsi que l’amplitude des transitoires Ca²⁺ indiquent une sensibilité à des modalités sensorielles spécifiques. Le diamètre des neurones fournit des preuves de types de fibres activées (mécano non nocif vs fibres nocives de la douleur, fibres Aβ, Aδ et C). Les neurones exprimant des récepteurs spécifiques peuvent être marqués génétiquement avec la tomate td-tomate et des recombinases Cre spécifiques avec Pirt-GCaMP. Par conséquent, l’imagerie Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ de DRG fournit un outil et un modèle puissants pour l’analyse de modalités sensorielles spécifiques et de sous-types de neurones agissant comme un ensemble au niveau de la population pour étudier la douleur, les démangeaisons, le toucher et d’autres signaux somatosensoriels.

Les neurones sensoriels primaires innervent directement la peau et ramènent l’information somatosensorielle au système nerveux central ^1,2. Les ganglions radiculaires dorsaux (DRG) sont des amas cellulaires de 10 000 à 15 000 neurones sensoriels primaires ^3,4. Les neurones DRG présentent divers modèles d’expression de taille, de myélinisation et de gènes et de récepteurs. Les neurones de plus petit diamètre comprennent les neurones sensibles à la douleur et les neurones de plus grand diamètre répondent généralement à des stimuli mécaniques non douloure....

Toutes les procédures décrites ici ont été effectuées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio.

NOTE: Une fois commencé, la chirurgie animale (étape 1) et l’imagerie (étape 2) doivent être complétées de manière continue. L’analyse des données (étape 3) peut être effectuée ultérieurement.

1. Chir.......

Figure 4 : Images représentatives des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3. (A,D) Des scans haute résolution à image unique des ganglions de la racine dorsale L5 de souris Pirt-GCaMP3 sont montrés. (B, E) . Projections d’intensité moyenne de 15 images de ganglions DRG de Pi.......

La douleur persistante est présente dans un large éventail de troubles, débilitante et/ou réduisant la qualité de vie d’environ 8% des personnes²⁹. Les neurones sensoriels primaires détectent les stimuli nocifs sur la peau, et leur plasticité contribue à la persistance de la douleur⁸. Bien que les neurones puissent être étudiés en culture cellulaire et explants, cela les éloigne de leur contexte physiologique normal. L’exposition chirurgicale du DRG, suivie .......

Ce travail a été soutenu par les subventions R01DE026677 et R01DE031477 des National Institutes of Health (à Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) et un prix Rising STAR du système de l’Université du Texas (Y.S.K.).