Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca²⁺ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca²⁺ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Die Ca 2+-Bildgebung kann als Proxy für die zelluläre Aktivität verwendet werden, einschließlich Aktionspotentialen und verschiedener Signalmechanismen, die den Eintritt von Ca 2+ in das Zytoplasma oder die Freisetzung intrazellulärer Ca ²⁺-Speicher beinhalten. Die Pirt-GCaMP3-basierte Ca²⁺ Bildgebung von primären sensorischen Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) in Mäusen bietet den Vorteil der gleichzeitigen Messung einer großen Anzahl von Zellen. Bis zu 1.800 Neuronen können überwacht werden, so dass neuronale Netzwerke und somatosensorische Prozesse als Ensemble in ihrem normalen physiologischen Kontext auf Populationsebene in vivo untersucht werden können. Die große Anzahl der überwachten Neuronen ermöglicht die Erkennung von Aktivitätsmustern, die mit anderen Methoden nur schwer zu erkennen wären. Stimuli können auf die Hinterpfote der Maus angewendet werden, so dass die direkten Auswirkungen von Stimuli auf das DRG-Neuronenensemble untersucht werden können. Die Anzahl der Neuronen, die Ca 2+-Transienten produzieren, sowie die Amplitude der Ca²⁺-Transienten weisen auf eine Sensitivität gegenüber bestimmten sensorischen Modalitäten hin. Der Durchmesser der Neuronen gibt Aufschluss über aktivierte Fasertypen (nicht-schädliche Mechano- vs. schädliche Schmerzfasern, Aβ-, Aδ- und C-Fasern). Neurone, die spezifische Rezeptoren exprimieren, können genetisch mit td-Tomato und spezifischen Cre-Rekombinasen zusammen mit Pirt-GCaMP markiert werden. Daher bietet die Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ Bildgebung von DRG ein leistungsfähiges Werkzeug und Modell für die Analyse spezifischer sensorischer Modalitäten und Neuronensubtypen, die als Ensemble auf Populationsebene fungieren, um Schmerz, Juckreiz, Berührung und andere somatosensorische Signale zu untersuchen.

Primäre sensorische Neuronen innervieren direkt die Haut und leiten somatosensorische Informationen zurück an das zentrale Nervensystem ^1,2. Dorsale Wurzelganglien (DRGs) sind Zellkörpercluster von 10.000-15.000 primären sensorischen Neuronen ^3,4. DRG-Neuronen weisen unterschiedliche Größe, Myelinisierungsgrade sowie Gen- und Rezeptorexpressionsmuster auf. Neuronen mit kleinerem Durchmesser umfassen schmerzempfindliche Neuronen, und Neuronen mit größerem Durchmesser reagieren typischerweise auf nicht-schmerzhafte mechanische Reize

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt wurde.

HINWEIS: Einmal begonnen, müssen die Tierchirurgie (Schritt 1) und die Bildgebung (Schritt 2) kontinuierlich abgeschlossen werden. Die Datenanalyse (Schritt 3) kann zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden.

1. Operation und Sich.......

Abbildung 4: Repräsentative Bilder von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen. (A,D) Hochauflösende Einzelbildscans von L5 dorsalen Wurzelganglien von Pirt-GCaMP3 Mäusen werden gezeigt. (B,E) . Durchschnittliche Intensitätsprojektionen von 15 Bildern von Pirt-GCaMP3 L5 DRG-Ganglien a.......

Anhaltende Schmerzen treten bei einer Vielzahl von Erkrankungen auf und beeinträchtigen und/oder verringern die Lebensqualität von etwa 8 % der Menschen²⁹. Primäre sensorische Neuronen erkennen schädliche Reize auf der Haut, und ihre Plastizität trägt zu anhaltenden Schmerzen bei⁸. Während Neuronen in Zellkulturen und Explantaten untersucht werden können, werden sie dadurch aus ihrem normalen physiologischen Kontext entfernt. Die chirurgische Exposition des DRG, gef.......

Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01DE026677 und R01DE031477 (an Y.S.K.), UTHSCSA Startup Fund (Y.S.K.) und einen Rising STAR Award der University of Texas System (Y.S.K.) unterstützt.