In vivo Imaging del calcio di insiemi neuronali in reti di neuroni sensoriali primari nei gangli della radice dorsale intatti

Questo protocollo descrive l'esposizione chirurgica del ganglio della radice dorsale (DRG) seguito da GCaMP3 (indicatore Ca²⁺ codificato geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca²⁺ imaging degli insiemi neuronali utilizzando topi Pirt-GCaMP3 mentre si applica una varietà di stimoli alla zampa posteriore omolaterale.

L'imaging di Ca 2+ può essere utilizzato come proxy per l'attività cellulare, compresi i potenziali d'azione e vari meccanismi di segnalazione che coinvolgono l'ingresso di Ca 2+ nel citoplasma o il rilascio di riserve intracellulari di Ca ²⁺. L'imaging Ca²⁺ basato su Pirt-GCaMP3 dei neuroni sensoriali primari del ganglio della radice dorsale (DRG) nei topi offre il vantaggio della misurazione simultanea di un gran numero di cellule. È possibile monitorare fino a 1.800 neuroni, consentendo di studiare le reti neuronali e i processi somatosensoriali come un insieme nel loro normale contesto fisiologico a livello di popolazione in vivo. Il gran numero di neuroni monitorati consente di rilevare modelli di attività che sarebbero difficili da rilevare utilizzando altri metodi. Gli stimoli possono essere applicati alla zampa posteriore del topo, consentendo di studiare gli effetti diretti degli stimoli sull'insieme dei neuroni DRG. Il numero di neuroni che producono transitori Ca 2+ e l'ampiezza dei transitori Ca²⁺ indicano sensibilità a specifiche modalità sensoriali. Il diametro dei neuroni fornisce prove di tipi di fibre attivate (meccano non nocivo vs fibre del dolore nocivo, fibre Aβ, Aδ e C). I neuroni che esprimono recettori specifici possono essere geneticamente marcati con td-Tomato e specifiche ricombinasi Cre insieme a Pirt-GCaMP. Pertanto, l'imaging Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ di DRG fornisce un potente strumento e modello per l'analisi di specifiche modalità sensoriali e sottotipi di neuroni che agiscono come un insieme a livello di popolazione per studiare dolore, prurito, tatto e altri segnali somatosensoriali.

I neuroni sensoriali primari innervano direttamente la pelle e trasportano le informazioni somatosensoriali al sistema nervoso centrale ^1,2. I gangli delle radici dorsali (DRG) sono gruppi di corpi cellulari di 10.000-15.000 neuroni sensoriali primari ^3,4. I neuroni DRG presentano diverse dimensioni, livelli di mielinizzazione e modelli di espressione genica e recettoriale. I neuroni di diametro più piccolo includono neuroni sensibili al dolore e neuroni di diametro maggiore rispondono tipicamente a stimoli meccanici non dolorosi

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Texas Health Science Center di San Antonio.

NOTA: Una volta iniziato, la chirurgia animale (fase 1) e l'imaging (fase 2) devono essere completati in modo continuo. L'analisi dei dati (fase 3) può essere eseguita successivamente.

1. Chirurgia e fissaggio dell'animale per l'imaging DRG L5 del lato .......

Figura 4: Immagini rappresentative dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (A,D) Vengono mostrate scansioni ad alta risoluzione a fotogramma singolo dei gangli della radice dorsale L5 dei topi Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proiezioni di intensità media di 15 fotogrammi di gangli Pirt-GCaMP3.......

Il dolore persistente è presente in una vasta gamma di disturbi, debilitanti e / o riducendo la qualità della vita per circa l'8% delle persone²⁹. I neuroni sensoriali primari rilevano stimoli nocivi sulla pelle e la loro plasticità contribuisce al dolore persistente⁸. Mentre i neuroni possono essere studiati in coltura cellulare ed espianti, così facendo li rimuove dal loro normale contesto fisiologico. L'esposizione chirurgica del DRG, seguita dall'imaging Pirt-GCaMP3.......

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (a Y.S.K.), dal fondo di avvio UTHSCSA (Y.S.K.) e da un Rising STAR Award del sistema dell'Università del Texas (Y.S.K.).