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Neuroscience

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

Published: February 10th, 2023

DOI:

10.3791/64826

1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+ イメージングした。

Ca2+イメージングは、活動電位および細胞質へのCa2+侵入または細胞内Ca2+貯蔵の放出を含む様々なシグナル伝達機構を含む細胞活動の代理として使用することができる。マウスの背根神経節(DRG)の一次感覚ニューロンのPirt-GCaMP3ベースのCa2+イメージングは、多数の細胞を同時に測定できるという利点を提供します。最大1,800個のニューロンをモニターできるため、ニューロンネットワークと体性感覚プロセスを、in vivoの集団レベルで通常の生理学的状況でアンサンブルとして研究できます。監視されるニューロンの数が多いため、他の方法では検出が困難な活動パターンを検出できます。刺激をマウスの後足に適用することができ、DRGニューロンアンサンブルに対する刺激の直接的な影響を研究することができます。Ca2+トランジェントを生成するニューロンの数とCa2+トランジェントの振幅は、特定の感覚様式に対する感受性を示しています。ニューロンの直径は、活性線維の種類(非侵害性メカノ線維と有害な疼痛線維、Aβ、Aδ、およびC線維)の証拠を提供します。特定の受容体を発現するニューロンは、Pirt-GCaMPと一緒にtd-Tomatoおよび特定のCreリコンビナーゼで遺伝的に標識することができます。したがって、DRGのPirt-GCaMP3 Ca2+イメージングは、痛み、かゆみ、触覚、およびその他の体性感覚信号を研究するための集団レベルでアンサンブルとして機能する特定の感覚モダリティおよびニューロンサブタイプの分析のための強力なツールとモデルを提供します。

一次感覚ニューロンは皮膚を直接神経支配し、体性感覚情報を中枢神経系に運び戻します1,2。背根神経節(DRG)は、10,000〜15,000個の一次感覚ニューロンの細胞体クラスターです3,4。DRGニューロンは、多様なサイズ、髄鞘形成レベル、および遺伝子および受容体発現パターンを提示します。より小さい直径のニューロンは、疼痛感知ニューロンを含み、より大きな直径のニューロンは、典型的には、非疼痛の機械的刺激に応答する5、6。傷害、慢性炎症、末梢神経障害などの一次感覚ニューロンの障害は、これらのニューロンをさまざまな刺激に感作し、慢性疼痛、異痛症、および疼痛過敏症に寄与する可能性があります7,8。したがって、DRGニューロンの研究は、一般的な体性感覚と多くの痛みやかゆみの障害の両方を理解する上で重要です。

生体内で発火するニューロンは体性感覚に不可欠であるが、最近まで、生体内で無傷の....

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ここに記載されているすべての手順は、サンアントニオのテキサス大学健康科学センターの施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実行されました。

注意: 開始したら、動物の手術(ステップ1)とイメージング(ステップ2)を継続的に完了する必要があります。データ解析(ステップ3)は、後で行ってもよい。

1.手術と?.......

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Figure 4
図4:Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の代表的な画像。 (A,D)Pirt-GCaMP3マウスのL5後根神経節の単一フレーム高解像度スキャンが示されている。(B,E).刺激がない場合の、パネルAおよびパネルDからのそれぞれ15フレームのPirt-GCaMP3 L5 D.......

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持続的な痛みはさまざまな障害に存在し、約8%の人々の生活の質を衰弱および/または低下させます29。一次感覚ニューロンは皮膚の有害な刺激を検出し、その可塑性は持続的な痛みに寄与します8。ニューロンは細胞培養や外植片で研究することができますが、そうすることで通常の生理学的状況からニューロンが取り除かれます。DRGの外科的曝露とそれに?.......

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この研究は、国立衛生研究所の助成金R01DE026677およびR01DE031477(Y.S.K.)、UTHSCSA startup fund(Y.S.K.)、およびテキサス大学システム(Y.S.K.)からのライジングスター賞によってサポートされました。

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

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