In vivo Kalsiumavbildning av nevronale ensembler i nettverk av primære sensoriske nevroner i intakte dorsale rotganglier

Denne protokollen beskriver kirurgisk eksponering av dorsalrotganglion (DRG) etterfulgt av GCaMP3 (genetisk kodet Ca²⁺ indikator; Grønt fluorescerende protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca²⁺ avbildning av nevronensemblene ved bruk av Pirt-GCaMP3-mus mens du bruker en rekke stimuli til den ipsilaterale bakpoten.

Ca 2+-avbildning kan brukes som proxy for cellulær aktivitet, inkludert aksjonspotensialer og forskjellige signalmekanismer som involverer Ca 2+ inngang i cytoplasma eller frigjøring av intracellulære Ca ²⁺ lagre. Pirt-GCaMP3-basert Ca²⁺-avbildning av primære sensoriske nevroner i dorsalrotganglion (DRG) hos mus gir fordelen av samtidig måling av et stort antall celler. Opptil 1,800 nevroner kan overvåkes, slik at nevrale nettverk og somatosensoriske prosesser kan studeres som et ensemble i sin normale fysiologiske kontekst på populasjonsnivå in vivo. Det store antallet nevroner som overvåkes, gjør det mulig å oppdage aktivitetsmønstre som ville være utfordrende å oppdage ved hjelp av andre metoder. Stimuli kan brukes på musens bakpote, slik at de direkte effektene av stimuli på DRG-nevronensemblet kan studeres. Antall nevroner som produserer Ca 2+ transienter samt amplituden til Ca²⁺ transienter indikerer følsomhet for spesifikke sensoriske modaliteter. Diameteren av nevroner gir bevis på aktiverte fibertyper (ikke-skadelig mekano vs. skadelige smertefibre, Aβ, Aδ og C-fibre). Nevroner som uttrykker spesifikke reseptorer kan genetisk merkes med td-tomat og spesifikke Cre-rekombinaser sammen med Pirt-GCaMP. Derfor gir Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ avbildning av DRG et kraftig verktøy og modell for analyse av spesifikke sensoriske modaliteter og nevronsubtyper som fungerer som et ensemble på populasjonsnivå for å studere smerte, kløe, berøring og andre somatosensoriske signaler.

Primære sensoriske nevroner innerverer huden direkte og bærer somatosensorisk informasjon tilbake til sentralnervesystemet ^1,2. Dorsal rotganglier (DRG) er cellekroppsklynger av 10.000-15.000 primære sensoriske nevroner ^3,4. DRG-nevroner presenterer forskjellig størrelse, myeliniseringsnivåer og gen- og reseptoruttrykksmønstre. Nevroner med mindre diameter inkluderer smertefølende nevroner og nevroner med større diameter reagerer vanligvis på ikke-smertefulle mekaniske stimuli ^5,6. Forstyrrelse....

Alle prosedyrer beskrevet her ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Texas Health Science Center i San Antonio.

MERK: Ved oppstart må dyrekirurgi (trinn 1) og bildediagnostikk (trinn 2) fullføres fortløpende. Dataanalyse (trinn 3) kan utføres senere.

1. Kirurgi og sikring av dyret for høyre side L5 DRG-avbildning

MERK: Både mannlige og kvinnelig.......

Figur 4: Representative bilder av L5 dorsalrotganglier av Pirt-GCaMP3-mus. (A,D) Enkeltramme høyoppløselige skanninger av L5 dorsale rotganglier av Pirt-GCaMP3-mus er vist. (B,E) . Gjennomsnittlig intensitetsprojeksjoner av 15 bilder Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglier fra henholdsvis panel A og panel D, .......

Vedvarende smerte er tilstede i et bredt spekter av lidelser, svekkende og / eller reduserer livskvaliteten for ca 8% av mennesker²⁹. Primære sensoriske nevroner oppdager skadelige stimuli på huden, og deres plastisitet bidrar til vedvarende smerte⁸. Mens nevroner kan studeres i cellekultur og eksplanter, fjerner det dem fra sin normale fysiologiske kontekst. Kirurgisk eksponering av DRG, etterfulgt av Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ avbildning, tillater studiet av primære s.......

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01DE026677 og R01DE031477 (til YSK), UTHSCSA oppstartsfond (YSK), og en Rising STAR Award fra University of Texas-systemet (YSK).