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Neuroscience

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Published: February 10th, 2023

DOI:

10.3791/64826

1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

A imagem por Ca 2+ pode ser usada como proxy da atividade celular, incluindo potenciais de ação e vários mecanismos de sinalização envolvendo a entrada de Ca 2+ no citoplasma ou a liberação de depósitos intracelulares de Ca2+. A imagem de Ca2+ baseada em Pirt-GCaMP3 de neurônios sensoriais primários do gânglio da raiz dorsal (DRG) em camundongos oferece a vantagem da medição simultânea de um grande número de células. Até 1.800 neurônios podem ser monitorados, permitindo que redes neuronais e processos somatossensoriais sejam estudados como um conjunto em seu contexto fisiológico normal em nível populacional in vivo. O grande número de neurônios monitorados permite a detecção de padrões de atividade que seriam difíceis de detectar usando outros métodos. Os estímulos podem ser aplicados na pata traseira do camundongo, permitindo que os efeitos diretos dos estímulos no conjunto de neurônios DRG sejam estudados. O número de neurônios produzindo transientes de Ca 2+, bem como a amplitude de transientes de Ca2+, indica sensibilidade a modalidades sensoriais específicas. O diâmetro dos neurônios fornece evidências de tipos de fibras ativadas (fibras mecanas não nocivas vs. fibras dolorosas nocivas, fibras Aβ, Aδ e C). Neurônios que expressam receptores específicos podem ser geneticamente marcados com td-Tomato e recombinases específicas de Cre juntamente com Pirt-GCaMP. Portanto, a imagem Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG fornece uma poderosa ferramenta e modelo para a análise de modalidades sensoriais específicas e subtipos de neurônios atuando como um conjunto em nível populacional para estudar dor, coceira, toque e outros sinais somatossensoriais.

Os neurônios sensoriais primários inervam diretamente a pele e transportam informações somatossensoriais de volta ao sistema nervoso central 1,2. Gânglios da raiz dorsal (DRGs) são aglomerados de corpos celulares de 10.000-15.000 neurônios sensoriais primários 3,4. Os neurônios DRG apresentam diversos tamanhos, níveis de mielinização e padrões de expressão gênica e receptora. Neurônios de menor diâmetro incluem neurônios sensíveis à dor e neurônios de maior diâmetro tipicamente respondem a estímulos mecânicos não dolorosos ....

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Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio.

NOTA: Uma vez iniciadas, a cirurgia dos animais (etapa 1) e os exames de imagem (etapa 2) devem ser concluídos de forma contínua. A análise dos dados (etapa 3) poderá ser realizada posteriormente.

1. Cirurgia e fixação do animal para ima.......

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Figure 4
Figura 4: Imagens representativas dos gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3. (A,D) Imagens de alta resolução de quadro único de gânglios da raiz dorsal L5 de camundongos Pirt-GCaMP3 são mostrados. (B,E) . Projeções de intensidade média de 15 quadros dos gânglios do Pirt-GCa.......

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A dor persistente está presente em uma ampla gama de distúrbios, debilitando e/ou reduzindo a qualidade de vida de cerca de 8% das pessoas29. Os neurônios sensoriais primários detectam estímulos nocivos na pele, e sua plasticidade contribui para a dor persistente8. Enquanto os neurônios podem ser estudados em cultura celular e explantes, fazê-lo os remove de seu contexto fisiológico normal. A exposição cirúrgica do DRG, seguida de Pirt-GCaMP3 Ca2+, per.......

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Este trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health Grants R01DE026677 e R01DE031477 (para Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) e um Rising STAR Award da University of Texas system (Y.S.K.).

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NameCompanyCatalog NumberComments
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

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