Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Этот протокол описывает хирургическое воздействие на ганглий дорсального корешка (DRG) с последующим GCaMP3 (генетически кодируемый индикатор Ca2+ ; Зеленый флуоресцентный белок-кальмодулин-белок M13 3) Ca2+ визуализация нейронных ансамблей с использованием мышей Pirt-GCaMP3 при применении различных стимулов к ипсилатеральной задней лапе.
Визуализация Ca 2+ может быть использована в качестве прокси для клеточной активности, включая потенциалы действия и различные сигнальные механизмы, включающие проникновение Ca 2+ в цитоплазму или высвобождение внутриклеточных запасов Ca2+. ВизуализацияCa 2+ на основе Pirt-GCaMP3 первичных сенсорных нейронов ганглия дорсального корешка (DRG) у мышей дает преимущество одновременного измерения большого количества клеток. Можно контролировать до 1,800 нейронов, что позволяет изучать нейронные сети и соматосенсорные процессы как ансамбль в их нормальном физиологическом контексте на популяционном уровне in vivo. Большое количество контролируемых нейронов позволяет обнаруживать паттерны активности, которые было бы сложно обнаружить с помощью других методов. Стимулы могут быть приложены к задней лапе мыши, что позволяет изучать прямое воздействие стимулов на ансамбль нейронов DRG. Количество нейронов, продуцирующих переходные процессы Ca2+, а также амплитуда переходных процессовCa2+ указывает на чувствительность к определенным сенсорным модальностям. Диаметр нейронов свидетельствует об активированных типах волокон (безвредные механические и вредные болевые волокна, волокна Aβ, Aδ и C). Нейроны, экспрессирующие специфические рецепторы, могут быть генетически помечены td-Tomato и специфическими рекомбиназами Cre вместе с Pirt-GCaMP. Таким образом, визуализация PIRT-GCaMP3 Ca2+ DRG предоставляет мощный инструмент и модель для анализа специфических сенсорных модальностей и подтипов нейронов, действующих как ансамбль на популяционном уровне для изучения боли, зуда, прикосновения и других соматосенсорных сигналов.
Первичные сенсорные нейроны непосредственно иннервируют кожу и переносят соматосенсорную информацию обратно в центральную нервную систему 1,2. Ганглии дорсальных корешков (DRG) представляют собой скопления клеточных тел из 10 000-15 000 первичных сенсорных нейронов 3,4. Нейроны DRG имеют различный размер, уровни миелинизации и паттерны экспрессии генов и рецепторов. Нейроны меньшего диаметра включают нейроны, чувствительные к боли, а нейроны большего диаметра обычно реагируют на безболезненные механические стимулы 5,6....
Все описанные здесь процедуры были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центра медицинских наук Техасского университета в Сан-Антонио.
ПРИМЕЧАНИЕ: После начала операции на животных (ша.......
Рисунок 4: Репрезентативные изображения ганглиев дорсальных корешков L5 мышей Pirt-GCaMP3. (A, D) Показано однокадровое сканирование с высоким разрешением ганглиев дорсальных корешков L5 мышей Pir.......
Постоянная боль присутствует при широком спектре расстройств, изнуряя и/или снижая качество жизни примерно у 8% людей29. Первичные сенсорные нейроны обнаруживают вредные раздражители на коже, а их пластичность способствует постоянной боли8. В то время как нейро.......
Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01DE026677 и R01DE031477 (для Y.S.K.), стартап-фондом UTHSCSA (Y.S.K.) и премией «Восходящая звезда» от системы Техасского университета (Y.S.K.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved