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Neuroscience

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

Published: February 10th, 2023

DOI:

10.3791/64826

1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

Las imágenes de Ca 2+ se pueden utilizar como un proxy de la actividad celular, incluidos los potenciales de acción y varios mecanismos de señalización que implican la entrada de Ca 2+ en el citoplasma o la liberación de reservas intracelulares de Ca2+. Las imágenes de Ca2+ basadas en Pirt-GCaMP3 de neuronas sensoriales primarias del ganglio de la raíz dorsal (DRG) en ratones ofrecen la ventaja de la medición simultánea de un gran número de células. Se pueden monitorizar hasta 1.800 neuronas, lo que permite estudiar redes neuronales y procesos somatosensoriales como un conjunto en su contexto fisiológico normal a nivel poblacional in vivo. El gran número de neuronas monitoreadas permite la detección de patrones de actividad que serían difíciles de detectar utilizando otros métodos. Los estímulos se pueden aplicar a la pata trasera del ratón, lo que permite estudiar los efectos directos de los estímulos en el conjunto de neuronas DRG. El número de neuronas que producen transitorios de Ca 2+, así como la amplitud de los transitorios de Ca2+ indica sensibilidad a modalidades sensoriales específicas. El diámetro de las neuronas proporciona evidencia de tipos de fibras activadas (mecanos no nocivos vs. fibras nocivas del dolor, fibras Aβ, Aδ y C). Las neuronas que expresan receptores específicos pueden ser marcadas genéticamente con td-Tomato y Cre específicas recombinasas junto con Pirt-GCaMP. Por lo tanto, las imágenes Pirt-GCaMP3 Ca2+ de DRG proporcionan una poderosa herramienta y modelo para el análisis de modalidades sensoriales específicas y subtipos de neuronas que actúan como un conjunto a nivel poblacional para estudiar el dolor, la picazón, el tacto y otras señales somatosensoriales.

Las neuronas sensoriales primarias inervan directamente la piel y llevan la información somatosensorial de vuelta al sistema nervioso central 1,2. Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son grupos de células corporales de 10.000-15.000 neuronas sensoriales primarias 3,4. Las neuronas DRG presentan diversos tamaños, niveles de mielinización y patrones de expresión de genes y receptores. Las neuronas de diámetro más pequeño incluyen neuronas sensibles al dolor y las neuronas de mayor diámetro típicamente responden a estímulos mecánicos no dolorosos

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Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio.

NOTA: Una vez iniciada, la cirugía con animales (paso 1) y las imágenes (paso 2) deben completarse de manera continua. El análisis de datos (paso 3) se puede realizar más adelante.

1. Cirugía y fijación del animal para la imagen L.......

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Figure 4
Figura 4: Imágenes representativas de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (A,D) Se muestran escaneos de alta resolución de fotograma único de los ganglios de la raíz dorsal L5 de ratones Pirt-GCaMP3. (B,E) . Proyecciones de intensidad media de 15 fotogramas de ganglios Pir.......

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El dolor persistente está presente en una amplia gama de trastornos, debilitando y/o reduciendo la calidad de vida de aproximadamente 8% de las personas29. Las neuronas sensoriales primarias detectan estímulos nocivos en la piel, y su plasticidad contribuye al dolor persistente8. Si bien las neuronas se pueden estudiar en cultivo celular y explantes, al hacerlo las elimina de su contexto fisiológico normal. La exposición quirúrgica del DRG, seguida de imágenes Pirt-GC.......

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01DE026677 y R01DE031477 de los Institutos Nacionales de Salud (a Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) y un premio Rising STAR del sistema de la Universidad de Texas (YSK).

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Anased Injection (Xylazine)Covetrus, Akorn33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DICCal Zeiss422642-9900-000
Cotton Tipped ApplicatorsMcKesson24-106-1S
Curved HemostatFine Science Tools13007-12
DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
DC Temperature Controller Heating PadFHC40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated ForcepsFine Science Tools11252-50
FHC DC Temperature ControllerFHC40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)MWI Animal Health, Piramal Group501017
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16221-14
GelFoamPfizer09-0353-01
Ketaset (Ketamine)ZoetisKET-00002R2
Luminescent Green Stage TapeJSITON/ AmazonB803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane VaporizerMidmark91305430
Micro dissecting scissorsRobozRS-5882
Micro dissecting spring scissorsFine Science Tools15023-10
Micro dissecting spring scissorsRobozRS-5677
Mini Rectal Thermistor ProbeFHC40-90-5D-02
Operating scissorsRobozRS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J miceJohns Hopkins UniversityN/AEither sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometerBioseb In vivo Research InstrumentsBIO-SMALGO
Stereotaxic frameKopf Model 923-B923-B
td-Tomato C57BL/6J miceJackson Laboratory7909
Top Plate, 6 in x 10 inNewport290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J miceJackson Laboratory17769
Zeiss LSM 800 confocal microscopeCal ZeissLSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition SoftwareCal ZeissZen (Blue Edition) 2.6

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