Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Detta protokoll beskriver den kirurgiska exponeringen av dorsalrotganglion (DRG) följt av GCaMP3 (genetiskt kodad Ca2+ indikator; Grönt fluorescerande protein-kalmodulin-M13-protein 3) Ca2+ avbildning av neuronensemblerna med hjälp av Pirt-GCaMP3-möss samtidigt som man applicerar en mängd olika stimuli på den ipsilaterala baktassen.
Ca 2+ avbildning kan användas som en proxy för cellulär aktivitet, inklusive åtgärdspotentialer och olika signalmekanismer som involverar Ca 2+ inträde i cytoplasman eller frisättning av intracellulära Ca 2+ butiker. Pirt-GCaMP3-baserad Ca2+ avbildning av primära sensoriska neuroner i dorsalrotganglion (DRG) hos möss erbjuder fördelen med samtidig mätning av ett stort antal celler. Upp till 1 800 neuroner kan övervakas, vilket gör att neuronala nätverk och somatosensoriska processer kan studeras som en ensemble i deras normala fysiologiska sammanhang på populationsnivå in vivo. Det stora antalet neuroner som övervakas möjliggör detektering av aktivitetsmönster som skulle vara utmanande att upptäcka med andra metoder. Stimuli kan appliceras på musens bakpot, vilket gör att de direkta effekterna av stimuli på DRG-neuronensemblen kan studeras. Antalet neuroner som producerar Ca 2+ transienter samt amplituden för Ca2+ transienter indikerar känslighet för specifika sensoriska modaliteter. Diametern hos neuroner ger bevis på aktiverade fibertyper (icke-skadliga mechano vs. skadliga smärtfibrer, Aβ, Aδ och C-fibrer). Neuroner som uttrycker specifika receptorer kan märkas genetiskt med td-tomat och specifika Cre-rekombinaser tillsammans med Pirt-GCaMP. Därför ger Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning av DRG ett kraftfullt verktyg och modell för analys av specifika sensoriska modaliteter och neuronsubtyper som fungerar som en ensemble på populationsnivå för att studera smärta, klåda, beröring och andra somatosensoriska signaler.
Primära sensoriska neuroner innerverar huden direkt och bär somatosensorisk information tillbaka till centrala nervsystemet 1,2. Dorsala rotganglier (DRG) är cellkroppskluster av 10 000-15 000 primära sensoriska neuroner 3,4. DRG-neuroner presenterar olika storlek, myeliniseringsnivåer och gen- och receptoruttrycksmönster. Neuroner med mindre diameter inkluderar smärtavkännande neuroner och neuroner med större diameter svarar vanligtvis på icke-smärtsamma mekaniska stimuli 5,6. Störningar i de ....
Alla procedurer som beskrivs här utfördes i enlighet med ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Texas Health Science Center i San Antonio.
OBS: När djurkirurgi (steg 1) och bilddiagnostik (steg 2) har påbörjats måste de slutföras kontinuerligt. Dataanalys (steg 3) kan utföras senare.
1. Kirurgi och säkring av djuret för höger sida L5 DRG-avbildning
OBS: Både .......
Figur 4: Representativa bilder av L5 dorsalrotsganglier hos Pirt-GCaMP3-möss. (A,D) Högupplösta skanningar med en bildruta av L5-dorsalrotsganglierna hos Pirt-GCaMP3-möss visas. (B,E) . Genomsnittliga intensitetsprojektioner av 15 ramar av Pirt-GCaMP3 L5 DRG ganglier från panel A respektive pan.......
Ihållande smärta är närvarande i ett brett spektrum av störningar, försvagande och / eller minskar livskvaliteten för cirka 8% av människor29. Primära sensoriska neuroner upptäcker skadliga stimuli på huden, och deras plasticitet bidrar till ihållande smärta8. Medan neuroner kan studeras i cellodling och explantat, tar det bort dem från deras normala fysiologiska sammanhang. Kirurgisk exponering av DRG, följt av Pirt-GCaMP3 Ca2+ avbildning, möjlig.......
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01DE026677 och R01DE031477 (till Y.S.K.), UTHSCSA startup fund (Y.S.K.) och en Rising STAR Award från University of Texas system (Y.S.K.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved