Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.
Ca 2 + görüntüleme, aksiyon potansiyelleri ve Ca 2 + sitoplazmaya girişi veya hücre içi Ca 2 + depolarının salınımını içeren çeşitli sinyal mekanizmaları dahil olmak üzere hücresel aktivite için bir proxy olarak kullanılabilir. Farelerde dorsal kök ganglionunun (DRG) birincil duyusal nöronlarının Pirt-GCaMP3 tabanlı Ca2+ görüntülemesi, çok sayıda hücrenin aynı anda ölçülmesinin avantajını sunar. 1.800'e kadar nöron izlenebilir, bu da nöronal ağların ve somatosensoriyel süreçlerin in vivo popülasyon düzeyinde normal fizyolojik bağlamlarında bir topluluk olarak incelenmesine izin verir. İzlenen çok sayıda nöron, diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olacak aktivite kalıplarının tespit edilmesini sağlar. Uyaranlar, fare arka pençesine uygulanabilir ve uyaranların DRG nöron topluluğu üzerindeki doğrudan etkilerinin incelenmesine izin verir. Ca2+ geçicilerini üreten nöronların sayısı veCa2+ geçicilerinin genliği, spesifik duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Nöronların çapı, aktif lif tiplerinin (zararlı olmayan mekanolara karşı zararlı ağrı lifleri, Aβ, Aδ ve C lifleri) kanıtını sağlar. Spesifik reseptörleri eksprese eden nöronlar, Pirt-GCaMP ile birlikte td-Domates ve spesifik Cre rekombinazları ile genetik olarak etiketlenebilir. Bu nedenle, DRG'nin Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntülemesi, ağrı, kaşıntı, dokunma ve diğer somatosensoriyel sinyalleri incelemek için popülasyon düzeyinde bir topluluk görevi gören spesifik duyusal modalitelerin ve nöron alt tiplerinin analizi için güçlü bir araç ve model sağlar.
Primer duyusal nöronlar doğrudan cildi innerve eder ve somatosensoriyel bilgiyi merkezi sinir sistemine geri taşır 1,2. Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), 10.000-15.000 birincil duyusal nöronunhücre gövdesi kümeleridir 3,4. DRG nöronları farklı boyutlarda, miyelinasyon düzeylerinde ve gen ve reseptör ekspresyon paternleri sunar. Daha küçük çaplı nöronlar ağrıyı algılayan nöronları içerir ve daha büyük çaplı nöronlar tipik olarak ağrılı olmayan mekanik uyaranlara cevap verir 5,6. Yaralanma, kro....
Burada açıklanan tüm prosedürler, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Bir kez başladıktan sonra, hayvan cerrahisi (adım 1) ve görüntüleme (adım 2) sürekli olarak tamamlanmalıdır. Veri analizi (adım 3) daha sonra yapılabilir.
1. Sağ taraf L5 DRG görüntüleme için hayvanın ameliyatı ve .......
Şekil 4: Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının temsili görüntüleri. (A,D) Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının tek kareli yüksek çözünürlüklü taramaları gösterilmiştir. (B,E) . Uyaranların yokluğunda, sırasıyla panel A ve panel D'den 15 kare P.......
Kalıcı ağrı, çok çeşitli bozukluklarda mevcuttur, insanların yaklaşık% 8'i için yaşam kalitesini zayıflatır ve / veya azaltır29. Birincil duyusal nöronlar ciltteki zararlı uyaranları tespit eder ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur8. Nöronlar hücre kültüründe ve eksplantlarda incelenebilirken, bunu yapmak onları normal fizyolojik bağlamlarından uzaklaştırır. DRG'nin cerrahi maruziyeti, ardından Pirt-GCaMP3 Ca2 + gör?.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anased Injection (Xylazine) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
Cotton Tipped Applicators | McKesson | 24-106-1S | |
Curved Hemostat | Fine Science Tools | 13007-12 | |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
DC Temperature Controller Heating Pad | FHC | 40-90-2-05 | |
Dumont Ceramic Coated Forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
FHC DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
Fluriso (Isoflurane) | MWI Animal Health, Piramal Group | 501017 | |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
Ketaset (Ketamine) | Zoetis | KET-00002R2 | |
Luminescent Green Stage Tape | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer | Midmark | 91305430 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
Micro dissecting spring scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
Micro dissecting spring scissors | Roboz | RS-5677 | |
Mini Rectal Thermistor Probe | FHC | 40-90-5D-02 | |
Operating scissors | Roboz | RS-6812 | |
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice | Johns Hopkins University | N/A | Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice. |
SMALGO small animal algometer | Bioseb In vivo Research Instruments | BIO-SMALGO | |
Stereotaxic frame | Kopf Model 923-B | 923-B | |
td-Tomato C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 7909 | |
Top Plate, 6 in x 10 in | Newport | 290-TP | |
TrpV1-Cre C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 17769 | |
Zeiss LSM 800 confocal microscope | Cal Zeiss | LSM800 | |
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved