Dette arbeidet ble støttet delvis av en avtale til forskningsdeltakelsesprogrammet ved Center for Devices and Radiological Health administrert av Oak Ridge Institute for Science and Education gjennom en tverretatlig avtale mellom US Department of Energy og US Food and Drug Administration. Forfatterne takker Richard Gray, Trent Robertson og Anna Avila for deres forslag og teknisk assistanse. Studien ble finansiert gjennom US Food and Drug Administration, Office of Science and Engineering Laboratories.

1. Klargjøring av plater og medier
MERK: En typisk ekstracellulær matriks (ECM)-basert hydrogelalikot er ~ 200 μL i et sterilt 1,5 ml rør lagret ved -20 ° C.
<ol><li>I en steril vevskulturhette klargjør du en steril 6-brønnsplate ved å overføre 2 ml 0,1 % gelatin (materialfortegnelse) til hver brønn. Plasser lokket på 6-brønnsplaten, og la den belagte platen ruge ved 37 °C i minst 1 time.</li>
	<li>En dag før du såer hiPSC-CMs på det fleksible hydrogelsubstratet, tine en hydrogel (Table of Materials) aliquot i kjøleskapet på is.</li>
	<li>Forbered kardiomyocytmediet (materialfortegnelse) ved å blande 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x B-27-tillegg og 5 ml penicillin-streptomycin9.</li>
</ol>2. Såing av kryopreserverte hiPSC-CMs
<ol><li>To dager før såing av hiPSC-CMs på det fleksible hydrogelsubstratet, pre-plate hiPSC-CMs på 0,1% gelatinbelagte sterile 6-brønnsplater. Tine hiPSC-CMs ved hjelp av en standard tineprotokoll 9,25.</li>
	<li>Deretter plater du totalt 1 500 000 hiPSC-CM (materialfortegnelse) per brønn i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1A)26.</li>
	<li>Dyrk hiPSC-CM i standard kardiomyocyttmedium i 2-4 dager for å la hiPSC-CMs komme seg fra kryopreserveringen ved 37 °C og 5% CO2. Oppdater det brukte mediet med 100% kardiomyocyttmedium hver 48.</li>
</ol>3. Dissosiasjon og telling av de forhåndsbelagte hiPSC-CMene
<ol><li>Kontroller statusen til hiPSC-CMs før dissosiasjon. Evaluer helsen til hiPSC-CMs, sikre levedyktighet og stabil juling. MERK: Renheten til hiPSC-CM-populasjonen er viktig (f.eks. >90% hjertetroponin T)7. En kardiomyocyttseleksjonsmetode (f.eks. metabolsk seleksjon eller sortering) anbefales for å redusere forstyrrelsen av hydrogelsubstratet av ikke-kardiomyocyttceller25,26.</li>
	<li>Vask hiPSC-CMs 2x med 4 ml per brønn D-PBS uten CaCl 2 eller MgCl2 (materialfortegnelse). Aspirer D-PBS, tilsett 1 ml romtemperatur dissosiasjonsreagens til hver brønn, og inkuber deretter i 15 minutter ved 37 °C.</li>
	<li>Tilsett 10 ml kardiomyositt medium til et sterilt 15 ml konisk rør.</li>
	<li>Dissosiere hiPSC-CMene fra 6-brønnsplaten med en 1000 μL pipette (figur 1B). Tilsett cellesuspensjonen til det koniske røret på 15 ml26.</li>
	<li>Skyll brønnen med 1 ml friskt kardiomyocyttmedium for å samle eventuelle gjenværende hiPSC-CM, og legg dem til det koniske røret på 15 ml. Ta det endelige volumet av det koniske røret til 15 ml.</li>
	<li>Sentrifuge i 5 min (200 × g). Fjern supernatanten opp til 1 ml merket. Resuspender cellene i kardiomyocyttmedium til et endelig volum på 5 ml.</li>
	<li>Tell hiPSC-CM-ene med en manuell eller automatisert celleteller.</li>
	<li>Inkuber hiPSC-CM-suspensjonen ved romtemperatur mens de fleksible hydrogelsubstratene tilberedes (maksimalt 30 minutter).</li>
</ol>4. Fremstilling av fleksible hydrogelsubstrater
<ol><li>Klargjør et 20 μL pipettesett ved 1 μL, 20 μL pipettespisser (f.eks. 20 μL) og en steril 48-brønns bunnplate i glass. Forsikre deg om at en stoppeklokke / tidtaker er klar før hydrogelsubstratene.</li>
	<li>I den sterile vevskulturhetten blander du det ECM-baserte hydrogelsubstratet ved å banke forsiktig på røret, og legg det umiddelbart tilbake på is.</li>
	<li>Start deretter stoppeklokken/timeren rett før det første hydrogelsubstratet er belagt - dette er tid null.</li>
	<li>Pipett 1 μL av hydrogelsubstratet opp og ned ~3x for å avkjøle pipettespissen. Påfør ~1 μL av det ufortynnede hydrogelsubstratet horisontalt på bunnen av hver brønn på 48-brønnsplaten (figur 1C, figur 2A og figur 3A), og hold pipetten i en 45° vinkel. Plate alle hydrogelsubstratene i samme retning i hver brønn (figur 2 og figur 3) for å identifisere substratet når du utfører forsøkene ved 40x forstørrelse 7,9,17,27. MERK: Hver ~1 μL-linje er ett hydrogelsubstrat (figur 3). Vanligvis tar det ~ 5 min å forberede 48 brønner. Bruken av et horisontalt skråstilt mikroplatestativ (f.eks. 30°) kan gi bedre oversikt over bunnen av brønnen og hydrogelsubstratet. Pass på å gå hele lengden av brønnen (dvs. fra venstre til høyre). Korte hydrogelsubstrater kan være for tykke, og dermed redusere substratstabiliteten. Ikke la hydrogelsubstratet tørke i pipettespissen. Hvis dette skjer, bytt raskt til et nytt tips, og fortsett umiddelbart. Alternativt kan kjølte pipettespisser brukes. Det ECM-baserte hydrogelsubstratet kan raskt polymeriseres når det ikke er på is. Det foreslås å lage flere brønner om gangen (f.eks. 10). I tillegg anbefales det å øve i en mock 48-brønns plate.</li>
	<li>Plasser lokket på 48-brønnsplaten, og la hydrogelsubstratene ruge i 8-10 minutter ved romtemperatur i den sterile vevskulturhetten før du legger til cellene (figur 2B). MERK: Det er viktig å følge de foreslåtte inkubasjonstidene. En inkubasjonstid på mer enn 10 minutter vil føre til stive hydrogelsubstrater og ingen synlige sammentrekninger. En inkubasjonstid på mindre enn 8 min kan føre til substrater som kollapser.</li>
	<li>Sådd umiddelbart hiPSC-CMene dråpevis direkte på hydrogelsubstratene, med ~30 000 levedyktige hiPSC-CM per brønn i et lavt middels volum på ~200 μL kardiomyocyttmedium, ved bruk av en 1000 μL pipette (figur 2B og figur 3B). MERK: Denne prosessen stopper polymerisasjonen av hydrogelsubstratet og sikrer at hiPSC-CM-ene er på substratet 7,9,17,27.</li>
	<li>Plasser lokket på platen, og la hiPSC-CMene ruge uforstyrret i 10-15 minutter ved romtemperatur (figur 2C) i den sterile vevskulturhetten slik at hiPSC-CMs kan feste seg til hydrogelsubstratet.</li>
	<li>Tilsett forsiktig ~100 μL ferskt kardiomyocyttmedium til hver brønn (endelig volum: ~300 μL per brønn). Legg lokket på tallerkenen, og overfør til en inkubator ved 37 °C, 5% CO 2 i2-4 dager. Oppdater 100% medium hver 24. time før sammentrekningsforsøkene utføres. MERK: Inspiser visuelt hiPSC-CMs for riktig morfologi; umiddelbart etter plating skal hiPSC-CMene være runde (figur 3B). På dag 2 etter såing vil en konfluent 2D hiPSC-CM monolagssyncytium bli observert (figur 3C) (tilleggsvideo S1) med robust synlig sammentrekning (tilleggsvideo S2).</li>
</ol>5. Registrering og analyse av sammentrekning
<ol><li>Klargjør CCM-analysemediet, som er Tyrodes oppløsning som inneholder følgende (i mmol/L): CaCl 2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glukose 10 og HEPES 10, med pH justert til 7,4 med NaOH, og sett i balanse til 37 °C i et vannbad. MERK: Submaksimalt ekstracellulært kalsium (0,5 mM) brukes til å forbedre CCM-analysevinduet.</li>
	<li>Slå på mikroskopet og miljøkontrollkammeret for å balansere til 37 °C og 5 % CO2.</li>
	<li>Fjern kardiomyocytmediet fra 48-brønnplaten, og skyll hver brønn forsiktig to ganger med 600 μL CCM-analysemedium.</li>
	<li>Tilsett 300 μL CCM-analysemedium per brønn, og plasser 48-brønnplaten på mikroskopet i miljøkontrollkammeret. Sett inn elektrodene, og balansere cellene i 5 minutter.</li>
	<li>Bruk videobasert mikroskopi for å ta opp sammentrekningsvideoene. Åpne videoopptaksprogramvaren, og angi en bildefrekvens på 100 bilder / s. Velg et interesseområde (ROI) nær midten av hiPSC-CM-monolaget. MERK: Ikke velg en avkastning nær kanten av hiPSC-CM-monolagene, da dette kan være ustabilt for kontraktile opptak.</li>
	<li>Deretter stimulerer feltet cellene med en kommersiell pulsgenerator (Table of Materials) for å sette elektrisk tempo på 2D hiPSC-CM monolagene. Tempo hiPSC-CMs ved 1,5x terskel ved 1 Hz med baseline pulsparametere (f.eks. monofasiske kvadratbølge pacing pulser med en 2 ms stimulus pulsvarighet på ~ 14 V / cm) 17.</li>
	<li>Ta opp grunnlinjen, bare pacing (dvs. før CCM) (figur 1D) sammentrekningsvideo for minst fem slag17,28.</li>
	<li>Deretter stimulerer du hiPSC-CM-monolaget med et eksperimentelt elektrisk signal (figur 1D). For å følge denne protokollen, bruk standard CCM-stimuleringsparametere: to symmetriske bifasiske pulser på 5,14 ms fasevarighet (20,56 ms total varighet), ~28 V / cm (faseamplitude), null interfaseintervall og en 30 ms forsinkelse (dvs. tid fra slutten av pacingpulsen til begynnelsen av CCM-pulsen) (figur 1D) 29,30 , og ta opp CCM-indusert sammentrekningsvideo i minst fem slag.</li>
	<li>Slå av CCM-signalet, stimuler med en baseline pacingpuls, og ta opp en sammentrekningsvideo av restitusjonsperioden (dvs. etter CCM) i minst fem slag.</li>
	<li>Bruk standard kontraksjonsprogramvare for automatisk å analysere kontraksjonsvideoene og kvantifisere de viktigste kontraktile egenskapene (f.eks. sammentrekningsamplitude, sammentrekningshelling, avslapningshelling, tid til topp, tid til baseline 90 % og sammentrekningsvarighet 50 %)7,17,31,32.</li>
	<li>Bruk 2D hiPSC-CM på det fleksible hydrogelsubstratet for kontraktile eksperimenter fra dag 2-14 etter plating på underlaget.</li>
</ol>

Denne artikkelen gjenspeiler synspunktene til forfatterne og bør ikke tolkes til å representere US Food and Drug Administration synspunkter eller politikk. Omtalen av kommersielle produkter, deres kilder eller deres bruk i forbindelse med materialet som er rapportert her, skal ikke tolkes som enten en faktisk eller underforstått godkjenning av slike produkter av Department of Health and Human Services. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser for dette arbeidet.

Protokollen som er skissert her beskriver en metode for å generere robust kontraherende 2D hiPSC-CM monolayers på et fleksibelt ekstracellulært matriks (ECM) -basert hydrogelsubstrat med kommersielle reagenser 7,17. HiPSC-CM-ene som sås på det fleksible hydrogelsubstratet forblir levedyktige og har forbedrede kontraktile egenskaper7. Denne teknikken er avhengig av standard laboratorieutstyr og evner7. Det er flere kritiske trinn i protokollen, inkludert i forhold til arbeid med ECM-basert hydrogelsubstrat, som krever nøye oppmerksomhet på detaljer. Et potensielt problem er tilstedeværelsen av serum i mediet. Dette kan føre til at hiPSC-CMene danner nettverk (f.eks. endoteliske/vaskulære nettverk) i stedet for et konfluent monolagsark; Derfor anbefales et serumfritt medium ved etablering av de fleksible hydrogel hiPSC-CM monolagene (dvs. dag 0 til dag 4). På samme måte kan tilberedning av for mange hydrogelsubstrater på en gang føre til dårlige eller ujevne underlag på grunn av operatørtretthet. Selv om det er viktig å jobbe raskt, er integriteten til hvert hydrogelsubstrat kritisk. På samme måte bør man forsiktig frø hiPSC-CMs og endre mediet; Dette bør ikke gjøres med kraft. Når du skifter medium, bør det tilsettes forsiktig fra brønnens øvre kant for ikke å forstyrre hydrogelsubstratet eller cellene. Som med standard 2D hiPSC-CM-kulturer (dvs. konvensjonell vevskulturplast eller glass), vil plating ved lav tetthet resultere i ufullstendig monolagsdannelse. Det er viktig å visuelt inspisere hiPSC-CMene for å bekrefte at de er på hydrogelsubstratet og å bruke en timer for å sikre nøyaktig timing. Videre kan dyrking av 2D hiPSC-CM monolayers i mer enn 14 dager på hydrogelsubstratet føre til monolagsforstyrrelser, basert på ECM-egenskapene og instruksjonene fra produsenten av substratet.
Det er flere begrensninger i dagens metode som må vurderes. For det første var cellene som ble brukt i denne protokollen fra en kommersiell hiPSC-CM-leverandør, og disse cellene danner et syncytium av elektrisk koblede celler. Syncytium inneholder en blanding av hiPSC-CM fra alle tre hjertesubtyper (dvs. ventrikulær, atriell og nodal)17. Studier kan ha nytte av en subtype-eksklusiv hiPSC-CM populasjon (dvs. 100% ventrikulær eller 100% atriell). For det andre brukte denne metoden bare hiPSC-CM, mens ikke-myocytter, inkludert hjertefibroblaster, endotelceller og nevroner, kan forbedre hiPSC-CM-funksjonaliteten22,36. For det tredje viser 2D hiPSC-CMs flere funksjoner i relativt umodne kardiomyocytter, inkludert spontan juling, amorf morfologi og mangel på inotrop respons 8,37. For det fjerde, mens denne protokollen produserer robust kontraherende 2D hiPSC-CM monolayers, er det sannsynlig at funksjonelt forbedrede 3D hiPSC-CM-modeller som konstruerte hjertevev (ECTs) vil resultere i en forbedret CCM-indusert kontraktil respons under fysiologiske kalsiumkonsentrasjoner 8,38. Til slutt er protokollen beskrevet her designet for et 48-brønnformat. Imidlertid, med optimalisering og inkludering av automatisering, kan dette skaleres til et format med høy gjennomstrømning (f.eks. 96-brønns eller 384-brønnplater).
Den nåværende gullstandarden for hiPSC-CM-studier er konvensjonelle stive 2D-kulturforhold (dvs. vevskulturplast eller glass). Mens den er nyttig for elektrofysiologi3 og kalsiumhåndtering39 studier, resulterer den konvensjonelle metoden i minimale kontraktile egenskaper 5,6,7. Som et resultat er konvensjonelle stive 2D-kulturforhold ikke egnet til vurdering av CCM-kontraktile effekter8. Funksjonelt forbedrede 3D hiPSC-CM ECT-metoder38 er teknisk utfordrende, tidkrevende og krever avansert utstyr som ikke er lett tilgjengelig i alle laboratorier. I denne protokollen beskriver vi en enkel metodikk for å generere robust kontraherende 2D hiPSC-CM monolayers i en kortere tidsramme enn 3D ECT-metoder eller langsiktige, konvensjonelle 2D-metoder 7,40,41. Videre er reagensene som brukes her kommersielt tilgjengelige, inkludert hydrogelsubstratet og hiPSC-CMene, og begge har betydelig lot-to-lot konsistens. Mens vi brukte avtakbare platinatrådelektroder (interelektrodeavstand: 2,0 mm, bredde: 1,0 mm), er forskjellige elektrodematerialer og konfigurasjoner egnet til CCM-kontraktile vurderinger in vitro 8,15,17,18,22. På samme måte er det flere automatiserte programvare tilgjengelig som muliggjør analyse av sammentrekningsvideoer 7,31,32.
De fleste prekliniske metoder for å evaluere kontraktilitet for medisinsk hjertemedisinsk utstyr er i stor grad avhengig av kostbare in vivo dyremodeller (f.eks. hunder eller griser) og teknisk utfordrende papillære muskelstrimler (f.eks. kaniner)18. Denne artikkelen beskrev en human in vitro-modell for å evaluere effekten av signaler fra medisinsk utstyr i hjertets elektrofysiologi på kontraktilitet. Dette verktøyet kan redusere avhengigheten av dyrestudier og være nyttig for in vitro-evaluering av kontraktile egenskaper til hjertets elektrofysiologiske utstyr.

Etter hvert som USAs befolkning blir eldre, fortsetter antall hjertesviktpasienter å stige, sammen med de direkte medisinske kostnadene 1,2. Det er et kritisk behov for å utvikle nye terapier for å behandle hjertesvikt og innovative ikke-kliniske metoder for å teste slike terapier. Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har blitt foreslått som et in vitro-verktøy for å hjelpe den terapeutiske utviklingsprosessen og har blitt brukt i regulatoriske innleveringer 3,4. Imidlertid har deres utbredte bruk vært begrenset for kontraktilitetsstudier på grunn av mangel på robuste kontraktile egenskaper når de er belagt under standard stive 2D-kulturforhold (dvs. konvensjonell vevskulturplast eller glass)5,6,7,8. Vi har tidligere demonstrert nytten av plating av isolerte enkle hiPSC-CM på et fleksibelt hydrogelsubstrat for å generere robuste synlige kontraktile egenskaper9. Vi viste at isolerte hiPSC-CM har sammenlignbare kontraktile egenskaper som hos nyisolerte voksne kaninventrikulære kardiomyocytter. Videre demonstrerte vi nytten av denne metoden for å vurdere kontraktile responser på farmakologiske midler7. Videre har andre studier brukt denne teknologien til mekanistiske vurderinger for grunnleggende vitenskap og sykdomsmodellering10,11,12. Her har denne metodikken blitt utvidet til 2D hiPSC-CM monolayers, og dens nytte i evaluering av fysiologisk relevante hjertekontraktilitetsmodulasjon (CCM) medisinsk utstyr elektriske signaler in vitro er demonstrert.
CCM er en intrakardial hjertesviktbehandling der ikke-eksitatoriske elektrofysiologiske signaler leveres til myokardiet i den absolutte ildfaste perioden av hjertesyklusen13,14. Reproduserbare metoder for å evaluere CCM i humane hjertecellemodeller mangler. Tidligere arbeid har benyttet ulike hjertecellemodeller for å evaluere CCM-kontraktil respons. Vi viste in vitro at nylig isolerte kaninventrikulære kardiomyocytter reagerer på CCM-stimulering ved en forbigående økning i kalsium og sammentrekningsamplitude15. En annen studie i isolerte ventrikulær kardiomyocytter hos hunder viste CCM-indusert forsterkning av den intracellulære kalsiumforbigående amplitude16. Imidlertid har flertallet av CCM-studier brukt ex vivo og in vivo animalske preparater. Disse studiene er vanskelige å korrelere med hverandre fordi de bruker en rekke CCM-pulsparametere og arter17. En studie i en isolert kaninpapillær modell viste økt CCM-indusert kontraktilitet8,18, og en rekke helhjertestudier har vist CCM-indusert forbedring av kontraktil funksjon19,20,21. Disse studiene har gitt viktig mekanistisk innsikt. Det mangler imidlertid reproduserbare humane modeller for in vitro kardiale EP-kontraktile studier, inkludert CCM. Mot dette formålet har vi utviklet flere 2D- og 3D hiPSC-modeller og demonstrert CCM-indusert forbedring av kontraktile egenskaper på en parameteravhengig måte. Videre har CCM-induserte inotrope effekter vist seg å være delvis mediert av nevroninngang og β-adrenerg signalering 8,17,22. Likevel må mer være kjent om mekanismene for CCM-terapi, og bruk av kontraherende humane kardiomyocytter kan hjelpe til med å oppnå dette resultatet. Som sådan er det et betydelig behov for å utvikle menneskelige ikke-kliniske verktøy for å evaluere nye CCM-enheter og signaler, raskere reguleringsprosessen, redusere byrden på dyremodeller og hjelpe enhetsutviklerens beslutningstaking 8,17,23,24. Det er viktig å utvikle enkle, gjør-det-selv-protokoller som kan overføres til ethvert laboratorium, og som bruker standardutstyr og lave cellekrav for å redusere kostnadene. Denne metoden belyser effekten av CCM-stimulering på human kardiomyocyttfunksjon og gir viktig innsikt i CCM-sikkerhet eller effektivitet17. Her beskriver vi metoden for å generere 2D hiPSC-CM monolayers på et fleksibelt hydrogelsubstrat for å produsere et standardisert ikke-klinisk verktøy for å kvantifisere akutt hjerteelektrofysiologi medisinsk utstyr (dvs. CCM) kontraktile responser i helse og sykdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7903</td>
			<td>Pre-plating Culture Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well Plate</td>
			<td>MatTek&#160;</td>
			<td>P48G-1.5-6-F</td>
			<td>Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>140675</td>
			<td>hiPSC-CM Culture, Plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, with insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>c70-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellOPTIQ Platform and Software&#160;</td>
			<td>Clyde Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Contraction Recording and Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tube 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>352099</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital CMOS Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-42U30</td>
			<td>Contraction Video Recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Cell Wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Control Chamber</td>
			<td>OKOLAB INC</td>
			<td>H201-K-FRAME</td>
			<td>Environmental Regulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1kg</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-600-107</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes Plating Medium</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>M1001</td>
			<td>hiPSC-CM Plating Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Cardiomyocytes2, 01434</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1017</td>
			<td>hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>50116047</td>
			<td>Maintain hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>Imaging hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>m33-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356230</td>
			<td>Flexible Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Hydrogel Substrate Aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 4100 Isolated High Power Stimulator</td>
			<td>AM-Systems</td>
			<td>Model 4100&#160;</td>
			<td>Pulse Generator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016</td>
			<td>Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.&#160;</td>
			<td>R1153</td>
			<td>DCM hiPSC-CMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette L-20</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette P1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123602G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 1000 ul</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips, 20 ul</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>GPS-L10S</td>
			<td>Making Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P330-500</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, with glucose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11875</td>
			<td>Cardiomyocyte Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>s641-212</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>Tyrode&#8217;s solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pacing and CCM Stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch/Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-261-840</td>
			<td>Plating Hydrogel Substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td>hiPSC-CM Counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>hiPSC-CM Dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of cardiac contractility modulation therapy in 2d human stem cell-derived cardiomyocytes

Humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) blir for tiden undersøkt for flere in vitro-applikasjoner og har blitt brukt i regulatoriske innleveringer. Her utvider vi bruken til sikkerhets- eller ytelsesvurderinger for hjertemedisinsk utstyr. Vi utviklet en ny metode for å evaluere kontraktile egenskaper for medisinsk utstyr i robust kontrahering av 2D hiPSC-CMs monolayers belagt på et fleksibelt ekstracellulært matriks (ECM) -basert hydrogelsubstrat. Dette verktøyet muliggjør kvantifisering av effekten av signaler fra hjerteelektrofysiologiske enheter på menneskelig hjertefunksjon (f.eks. kontraktile egenskaper) med standard laboratorieutstyr. 2D hiPSC-CM monolayers ble dyrket i 2-4 dager på et fleksibelt hydrogelsubstrat i et 48-brønns format.
HiPSC-CM-ene ble eksponert for standard elektriske signaler fra medisinsk utstyr (CCM) og sammenlignet med kontrollsignaler (dvs. kun pacing) hiPSC-CM. De grunnleggende kontraktile egenskapene til 2D hiPSC-CM-ene ble kvantifisert ved videobasert deteksjonsanalyse basert på pikselforskyvning. De CCM-stimulerte 2D hiPSC-CM-ene belagt på det fleksible hydrogelsubstratet viste signifikant forbedrede kontraktile egenskaper i forhold til baseline (dvs. før CCM-stimulering), inkludert økt maksimal kontraksjonsamplitude og akselerert kontraksjonskinetikk. Videre muliggjør bruken av det fleksible hydrogelsubstratet multipleksing av de videobaserte hjerte-eksitasjonskontraksjonskoblingsavlesningene (dvs. elektrofysiologi, kalsiumhåndtering og sammentrekning) hos friske og syke hiPSC-CMer. Nøyaktig påvisning og kvantifisering av effekten av hjertets elektrofysiologiske signaler på human hjertekontraksjon er avgjørende for utvikling, optimalisering og de-risking av hjertemedisinsk utstyr. Denne metoden muliggjør robust visualisering og kvantifisering av hjertesyncytiums kontraktile egenskaper, noe som bør være verdifullt for ikke-klinisk hjertemedisinsk utstyrssikkerhet eller effektivitetstesting. Denne artikkelen beskriver i detalj metoden for å generere 2D hiPSC-CM hydrogelsubstratmonolag.

Beskrevet i denne protokollen er et enkelt, robust verktøy for å generere synlig kontraherende 2D hiPSC-CM monolayers på et fleksibelt hydrogelsubstrat. Måling av kontraktile egenskaper oppnås med videobasert opptak kombinert med kontraktilitetsanalyseprogramvare. Dette muliggjør kvantifisering av nøkkelparametere for kardiomyocyttens kontraktilitet, inkludert sammentrekningsamplitude, sammentrekningshelling, avslapningshelling, tid til topp, tid til baseline 90 % og sammentrekningsvarighet 50 %. Modellen brukes til å karakterisere baseline kontraktile egenskaper til hiPSC-CMs (figur 4) fra ulike "friske" donorer og kan utvides til evaluering av hjerte-elektrofysiologiske medisinske utstyrssignaler (dvs. CCM). Anvendelsen av standard CCM-stimuleringsparametere (figur 1D)29,30 resulterte i forbedrede kontraktile egenskaper in vitro (figur 5 og tabell 1)17.
Vi demonstrerte videre at denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av modulering av ekstracellulære kalsiumkonsentrasjoner på humane kontraktile egenskaper med og uten CCM-stimulering (figur 6) 17. Den forventede baseline kalsiumavhengigheten av sammentrekning ble observert 7,17, samt en CCM-indusert økning i kalsiumfølsomhet på nivået av kardiomyocytt monolaget. I tillegg viste den farmakologiske undersøkelsen av den β-adrenerge signalveien (figur 7) at CCM-induserte inotrope effekter delvis var mediert av β-adrenerge signaler17. Videre kan dette verktøyet utvides til pasientspesifikke sykdomskardiomyocytter, inkludert de av dilatert kardiomyopati (DCM)33,34,35 (figur 8), for å forstå effekten av CCM i sammenheng med sykdomstilstander; Faktisk ble det observert forbedret kontraktil amplitude og akselerert kontraksjonskinetikk og relaksasjonskinetikk ved CCM-"dosen" som ble testet her (figur 8). Mens vi har en CCM-etterlignende enhet i laboratoriet vårt, er metodikken som brukes her ikke spesifikk for det systemet og kan brukes på andre hjerteelektrofysiologiske enheter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk sammendrag av 2D hiPSC-CM in vitro CCM-modellen. (A) HiPSC-CM-ene er forhåndsbelagt i monolagsformat på gelatin (0,1%)-belagte 6-brønnsplater. (B) Etter 2 dager i kultur dissosieres hiPSC-CMene og klargjøres for plating på et fleksibelt hydrogelsubstrat. (C) De isolerte hiPSC-CMene er belagt med høy tetthet på hydrogelsubstrater arrangert i et 48-brønnformat (venstre) og analyseres i (0,5 mM) ekstracellulært kalsium Tyrodes løsning (høyre). (D) En kommersiell pulsgenerator og standard kliniske CCM-pulsparametere29,30 (høyre) brukes til å stimulere hiPSC-CMs; Hjertefunksjonen vurderes ved videobasert analyse (venstre). (E) Representative kontraksjonsregistreringer før CCM (baseline: 5 V), under CCM (CCM: 10 V) og etter CCM (gjenoppretting: 5 V). Denne figuren er gjengitt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk fremstilling av det fleksible hydrogelsubstratet plating og såing. (A) Fullstendig tint, ufortynnet ECM-basert hydrogelsubstrat påføres en steril 48-brønnsplate (venstre panel), med 1 μL hydrogelsubstrat per brønn (høyre panel). (B) Hydrogelsubstratet får lov til å inkubere ved romtemperatur i 8-10 minutter (høyre panel), etterfulgt av plating av hiPSC-CM med høy tetthet i et lavt mediumvolum (~ 200 μL) (venstre panel). (C) Etter 10-15 min inkubasjon tilsettes medium til hver brønn (venstre panel), og platene flyttes til en standard vevskulturinkubator (høyre panel). Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrise, hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; RT = romtemperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig03.jpg"> Figur 3: Ekstracellulært matriksbasert hydrogelsubstrat. (A) Representativt hydrogelsubstrat (ingen celler) i en brønn på en 48-brønns glassbunnplate umiddelbart etter at substratet er påført brønnen. (B) Tid 0 etter at hiPSC-CMs er seedet. (C) Tid 24 timer etter at hiPSC-CMs er sådd. Dette panelet ble gjengitt fra Feaster et al.17. De hvite pilene indikerer kanten av hydrogelsubstratet, 4x forstørrelse. Skala bar = 1 mm. Forkortelse: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig04.jpg"> Figur 4: Karakterisering av 2D hiPSC-CM monolags kontraktile egenskaper. (A) Representativ kontraksjonsregistrering av 2D hiPSC-CMs tempo ved 1 Hz (5 V). (B) Representative kontraksjonsspor som viser en kontraksjonssyklus. (C) Sammendrag søylediagrammer. Dataene er gjennomsnittlige ± SEM. n = 18. Forkortelse: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig05.jpg"> Figur 5: Akutt effekt av CCM på 2D hiPSC-CM kontraktile egenskaper. (A) Representativ kontraksjonsregistrering for før CCM (5 V), under CCM (10 V) og etter CCM (5 V). (B) Representative kontraksjonsspor av de umiddelbare effektene (dvs. siste før-CCM-takt, første CCM-slag og første etter-CCM-beat, indikert med +). (C) Sammendrag av søylediagrammer over de umiddelbare virkningene. Prosentvis endring, data er gjennomsnitt ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figuren er gjengitt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av ekstracellulær kalsiummodulasjon på CCM-responsen. (A) Representative sammentrekningsspor av de umiddelbare virkningene for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og etter CCM (5 V); hiPSC-CM ble utsatt for økende konsentrasjoner av ekstracellulært kalsium (Cao) på 0,25-2 mM. (VG Nett) Transformerte data (sigmoidal) for å veilede øyet som demonstrerer effekten av CCM på kalsiumfølsomheten til kontraktile egenskaper (dvs. amplitude og kinetikk) (bakkehelling = 1,0). n = 6-8 per gruppe. Denne figuren er gjengitt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig07.jpg"> Figur 7: Farmakologisk utfordring. Representative kontraksjonsspor for hver gruppe før CCM (5 V), under CCM (10 V) og etter CCM (5V); hiPSC-CM ble forbehandlet med (A) vehikkel eller (B) metoprolol (2 μM). (C,D) Sammendrag av stolpediagrammer for hver tilstand. Prosentvis endring, data er gjennomsnitt ± SEM. n = 10 per gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne figuren er gjengitt fra Feaster et al.17. Forkortelser: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64848/64848fig08.jpg"> Figur 8: Akutt effekt av CCM på kontraktile egenskaper hos syke 2D hiPSC-CMs. (A) Representativt kontraksjonsspor for DCM L35P, kontrollbaseline (før, 6 V) og DCM L35P pluss CCM (10 V). (B) Sammendrag søylediagrammer. Prosentvis endring, data er gjennomsnitt ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Forkortelser: hiPSC-CM = humanindusert pluripotent stamcelleavledet kardiomyocytt; CCM = hjertekontraktilitetsmodulering; DCM = dilatert kardiomyopati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/64848fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsvideo S1: Timelapse av hiPSC-CM på den ekstracellulære matriksbaserte hydrogelen. Todimensjonale hiPSC-CMs belagt på det fleksible hydrogelsubstratet; Tid: 0-90 t; en brønn med en 48-brønns glassbunnplate; 4x forstørrelse. HiPSC-CMene danner et horisontalt monolagssyncytium (dvs. fra venstre til høyre). Skalastang = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Supplerende video S2: hiPSC-CMs på den ekstracellulære matriksbaserte hydrogelen. Todimensjonale hiPSC-CMs belagt på det fleksible hydrogelsubstratet; Tid: ~ 24 h; en brønn med en 48-brønns glassbunnplate; 4x forstørrelse. HiPSC-CM-ene danner monolagsmorfologi og viser robust sammentrekning ved ~24 timer etter plating. Skala bar = 1 mm. Denne videoen er fra Feaster et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64848/Supplemental%20Video%202.m4v" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>CCM</td>
			<td>Etter</td>
		</tr><tr><td>Amplitude</td>
			<td>16 ± 4 %**</td>
			<td>4 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til topp 50%</td>
			<td>-20 ± 9%*</td>
			<td>7 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til topp 90%</td>
			<td>-22 ± 8%*</td>
			<td>6 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Tid til baseline 50 %</td>
			<td>-8 ± 5%</td>
			<td>4 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>Tid til baseline 90 %</td>
			<td>-12 ± 6%*</td>
			<td>5 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Varighet av sammentrekninger 10%</td>
			<td>-13 ± 6%</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Varighet av sammentrekning 50%</td>
			<td>-6 ± 5 %</td>
			<td>3 ± 5%</td>
		</tr><tr><td>Varighet av sammentrekning 90%</td>
			<td>0 ± 5%</td>
			<td>3 ± 4%</td>
		</tr><tr><td>N</td>
			<td>23</td>
			<td>23</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Kontraktile egenskaper. Prosentvis endring i forhold til før CCM (5 V); dataene er gjennomsnittlige ± SEM for alle slag i hver gruppe under CCM (10 V) og etter CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Denne tabellen er gjengitt fra Feaster et al.17.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Her demonstrerer vi en ikke-invasiv hjertemedisinsk enhetskontraktilitetsevalueringsmetode ved bruk av 2D humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytt (hiPSC-CM) monolag, belagt på et fleksibelt substrat, kombinert med videobasert mikroskopi. Dette verktøyet vil være nyttig for in vitro-evaluering av kontraktile egenskaper til hjerteelektrofysiologiske enheter.

Evaluering av hjertekontraktilitetsmodulasjonsterapi i 2D humane stamcelleavledede kardiomyocytter

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...

Office of Science and Engineering Laboratories ved FDA utvikler regulatoriske vitenskapsverktøy for å hjelpe utviklere av medisinsk utstyr og FDA-anmeldere. Vårt endelige mål er å akselerere pasientenes tilgang til innovativt, trygt og effektivt medisinsk utstyr gjennom den beste tilgjengelige vitenskapen. I denne protokollen bruker vi banebrytende indusert pluripotent stamcelleteknologi til vurdering av medisinsk utstyr som brukes til å behandle livstruende hjertesykdommer.Dette enkle verktøyet muliggjør reproduserbar evaluering av hjertets elektrofysiologiske enheter i parabolen ved hjelp av standard laboratorieutstyr. Det kan også brukes med pasientspesifikke celler avledet fra donorer med ulike hjertesykdommer. For å begynne, plate de tinte humane iPSC-avledede kardiomyocyttene på 0,1 % gelatinbelagte sterile seksbrønnsplater minst to dager før såing av kardiomyocyttene på det fleksible hydrogelsubstratet.Kultur de humane iPSC-avledede kardiomyocyttene i standard kardiomyocyttmedium i to til fire dager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for å tillate dem å komme seg fra kryokonserveringen. Oppdater det brukte mediet med 100 % kardiomyocyttmedium hver 48. Kontroller statusen til de humane iPSC-avledede kardiomyocyttene før dissosiasjon ved å evaluere helsen til cellene, sikre levedyktighet og stabil juling.Vask kardiomyocyttene med fire milliliter per brønn DPBS uten kalsiumklorid eller magnesiumklorid. Tilsett en milliliter romtemperatur dissosiasjonsreagens til hver brønn og inkuber i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Deretter tilsettes 10 ml kardiomyocytmedium til et sterilt 15 milliliter konisk rør.Dissociate kardiomyocyttene fra seksbrønnplatene med en 1.000 mikroliter pipette og tilsett cellesuspensjonen til det koniske røret. Skyll brønnene med en milliliter friskt kardiomyocyttmedium for å samle eventuelle gjenværende kardiomyocytter og legg dem til det koniske røret. Ta deretter det endelige volumet av det koniske røret til 15 ml med mediet.Sentrifuger røret ved 200 G i fem minutter og fjern supernatanten opp til en milliliters merke. Resuspender cellene i kardiomyocyttmediet til et endelig volum på fem milliliter og tell kardiomyocyttene med en manuell eller automatisert celleteller. Deretter inkuberer du kardiomyocyttcellesuspensjonen i ca. 30 minutter ved romtemperatur mens de fleksible hydrogelsubstratene fremstilles.Klar en 20 mikroliters pipette satt på en mikroliter, pipettespisser, en steril 48-brønns glassbunnplate og en stoppeklokketimer i vevskulturhetten. Bland den ekstracellulære matriksen eller ECM-baserte hydrogelsubstratet ved å banke forsiktig på røret og umiddelbart legge det tilbake på is. Start stoppeklokketimeren umiddelbart før plating av det første hydrogelsubstratet og merk dette som tid null.Pipett én mikroliter av hydrogelsubstratet opp og ned ca. tre ganger for å avkjøle pipettespissen. Påfør deretter omtrent en mikroliter av det ufortynnede hydrogelsubstratet horisontalt på bunnen av hver brønn i 48-brønnplaten, og hold pipetten i en 45 graders vinkel. Plate alle hydrogelsubstratene i samme retning i hver brønn for å identifisere substratet når du utfører forsøkene ved 40X forstørrelse.Plasser lokket på 48-brønnsplaten og la hydrogelsubstratene inkubere i åtte til 10 minutter ved romtemperatur i vevskulturhetten før du legger til cellene. Etter inkubasjonen frøs kardiomyocyttene umiddelbart direkte på hydrogelsubstratene med ca. 30.000 levedyktige kardiomyocytter per brønn i et lavt middels volum på ca. 200 mikroliter kardiomyocytmedium. Etter å ha lukket lokket, la kardiomyocyttene inkubere uforstyrret i 10 til 15 minutter ved romtemperatur i hetten for å gjøre det mulig for cellene å feste seg til hydrogelsubstratet.Tilsett forsiktig 100 mikroliter friskt kardiomyocytmedium til hver brønn. Plasser lokket lukket plate på en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i to til fire dager. Slå på mikroskopet og miljøkontrollkammeret for å balansere til 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Fjern kardiomyocytmediet fra 48-brønnplaten og skyll hver brønn forsiktig to ganger med 600 mikroliter av hjertekontraktilitetsmodulasjonen eller CCM-analysemediet. Deretter tilsettes 300 mikroliter CCM-analysemedium per brønn og plasserer 48-brønnplaten på mikroskopet i miljøkontrollkammeret. Sett inn elektrodene og balanser cellene i fem minutter.For å spille inn sammentrekningsvideoene ved hjelp av videobasert mikroskopi, åpne videoopptaksprogramvaren og angi en bildefrekvens på 100 bilder per sekund. Velg deretter en region av interesse eller avkastning nær midten av hiPSC-CM-monolaget. Deretter stimulerer feltet cellene med en kommersiell pulsgenerator for å elektrisk tempo 2D kardiomyocytter monolayers.Plasser kardiomyocytten ved 1,5 ganger terskel ved en hertz med baseline pulsparametere. For eksempel pulserer monofasisk firkantbølgepacing med en to millisekunders stimuluspulsvarighet på fem volt. Ta opp baseline pacing bare sammentrekningsvideo før CCM i minst fem slag.Deretter stimulerer kardiomyocyttene monolag med et eksperimentelt elektrisk signal på 30 millisekunder forsinkelse, to symmetriske bifasiske pulser med 5,14 millisekunder fasevarighet, med 20,56 millisekunder total varighet, 10 volt faseamplitude og null interfaseintervall. Ta opp CCM-indusert sammentrekningsvideo i minst fem slag. Slå av CCM-signalet, stimuler med en baseline pacingpuls og ta opp en sammentrekningsvideo av restitusjonsperioden etter CCM i minst fem slag.Bruk en standard kontraksjonsprogramvare for å analysere sammentrekningsvideoene automatisk og kvantifisere de viktigste kontraktile egenskapene som sammentrekningsamplitude, sammentrekningshelling, avslapningshelling, tid til topp, tid til baseline 90% og sammentrekningsvarighet 50%2D humane iPSC-avledede kardiomyocytter monolags kontraktuelle egenskaper ble karakterisert og nøkkelparametrene for kardiomyocytkontraktilitet ble kvantifisert. Anvendelsen av standard CCM-stimuleringsparametere resulterte i forbedrede kontraktile egenskaper in vitro. Effektene av ekstracellulær kalsiumkonsentrasjonsmodulering på humane kontraktile egenskaper med og uten CCM-stimulering ble evaluert.Den forventede baseline kalsiumavhengigheten av sammentrekning ble observert, samt en CCM-indusert økning i kalsiumfølsomhet på nivået av kardiomyocytt monolaget. I tillegg viste den farmakologiske undersøkelsen av den androgene beta-signalveien at CCM-induserte inotrope effekter delvis var mediert av beta-adrenerg signalering. Videre kan dette verktøyet utvides til pasientspesifikke sykdomskardiomyocytter, inkludert de av dilatert kardiomyopati for å forstå effekten av CCM i sammenheng med sykdomstilstander.Her fokuserer vi primært på å evaluere menneskelige kontraktile egenskaper. Ved hjelp av dette verktøyet kan man imidlertid også evaluere andre avlesninger av hjerteeksitasjonskontraksjonskoblinger, inkludert aksjonspotensialer og kalsiumhåndtering. Dette er det første regulatoriske vitenskapsverktøyet som kombinerer indusert pluripotent stamcelle ved teknologi med vurdering av hjerteenheter.Denne alternative metoden baner vei for at medisinsk utstyr kan vurderes i en skål og har potensial til å redusere behovet for testing av dyr og mennesker.

Evaluering av hjertekontraktilitetsmodulasjonsterapi i 2D humane stamcelleavledede kardiomyocytter

Abstract