Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي
المواد العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) يمكنها تقليد بيئة الورم في المختبر. في سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة ، تمثل PDOs نموذجا لدراسة المؤشرات الحيوية والعلاجات الجديدة.
Organoids هي نماذج الورم الديناميكي 3D التي يمكن أن تنمو بنجاح من أنسجة ورم المبيض المشتقة من المريض ، أو الاستسقاء ، أو السائل الجنبي وتساعد في اكتشاف علاجات جديدة ومؤشرات حيوية تنبؤية لسرطان المبيض. تلخص هذه النماذج عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أنها تتطابق مع الورم الرئيسي من الناحية الشكلية والخلوية والكيميائية المناعية ووراثيا. وبالتالي ، فإن المواد العضوية تسهل البحث عن الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم وتتفوق على خطوط الخلايا. يصف البروتوكول الحالي طرقا متميزة لتوليد عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض من أورام المرضى والاستسقاء وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يتم فصل عينات المريض إلى معلقات خلوية عن طريق الهضم الميكانيكي والأنزيمي. ثم يتم طلاء الخلايا باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي (BME) ويتم دعمها بوسائط نمو محسنة تحتوي على مكملات خاصة بزراعة سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). بعد تشكيل المواد العضوية الأولية ، يمكن ل PDOs الحفاظ على ثقافة طويلة الأجل ، بما في ذلك المرور للتوسع في التجارب اللاحقة.
في عام 2021 ، تم تشخيص ما يقرب من 21,410 امرأة في الولايات المتحدة حديثا بسرطان المبيض الظهاري ، وتوفيت 12,940 امرأة بسبب هذا المرض1. على الرغم من إحراز تقدم كاف في الجراحة والعلاج الكيميائي ، إلا أن أكثر من 70٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم يطورون مقاومة العلاج الكيميائي ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة لعلاج هذا المرض الفتاك ونماذج تمثيلية موثوقة للبحوث قبل السريرية.
خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) التي تم إنشاؤها من أورام المبيض الأولية هي الأدوات الرئيسية المستخدم....
تم الحصول على جميع عينات الأنسجة البشرية التي تم جمعها للبحث وفقا للبروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). تم تنفيذ البروتوكولات الموضحة أدناه في بيئة زراعة الأنسجة البشرية المعقمة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من البشر. يجب أن يكون لدى المرضى المؤهلين تشخيص أو تشخيص مفترض ل.......
لتوليد PDOs ، تم هضم العينات ميكانيكيا وإنزيميا في معلقات أحادية الخلية. ثم أعيد تعليق الخلايا في BME واستكملت بوسائط مصممة خصيصا (الشكل 3). عادة ما يتم إنشاء المواد العضوية على مدى إطار زمني مدته 10 أيام ، وبعد ذلك تظهر عضويات منفصلة في الثقافة (الشكل 4).
سرطان المبيض مميت للغاية بسبب مرحلته المتقدمة في التشخيص ، فضلا عن التطور الشائع لمقاومة العلاج الكيميائي. تم إحراز العديد من التطورات في أبحاث سرطان المبيض من خلال استخدام خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. ومع ذلك ، هناك حاجة واضحة لنموذج أكثر تمثيلا وبأسعار معقولة في المختبر . أثبت?.......
نحن ممتنون لتوجيهات رون بوس ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ، ومساعدة باربرا بلاشوت ، دكتوراه في الطب ، في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج الباحث العلمي بجامعة واشنطن ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved