Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Patientafledte organoider (PDO) er en tredimensionel (3D) kultur, der kan efterligne tumormiljøet in vitro. I højkvalitets serøs kræft i æggestokkene repræsenterer BDO'er en model til at studere nye biomarkører og terapi.
Organoider er 3D dynamiske tumormodeller, der kan dyrkes med succes fra patientafledt ovarietumorvæv, ascites eller pleurvæske og hjælpe med opdagelsen af nye terapeutiske og prædiktive biomarkører for kræft i æggestokkene. Disse modeller rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og celle-celle- og cellematrixinteraktioner. Derudover har de vist sig at matche den primære tumor morfologisk, cytologisk, immunhistokemisk og genetisk. Således letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er bedre end cellelinjer. Denne protokol beskriver forskellige metoder til at generere patientafledte ovariecancerorganoider fra patienttumorer, ascites og pleurvæskeprøver med en succesrate på mere end 97%. Patientprøverne adskilles i cellulære suspensioner ved både mekanisk og enzymatisk fordøjelse. Cellerne belægges derefter ved hjælp af et kældermembranekstrakt (BME) og understøttes med optimerede vækstmedier, der indeholder kosttilskud, der er specifikke for dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC). Efter dannelse af indledende organoider kan BOB'erne opretholde langsigtet kultur, herunder passaging til ekspansion til efterfølgende eksperimenter.
I 2021 blev cirka 21,410 kvinder i USA nyligt diagnosticeret med epitelial kræft i æggestokkene, og 12,940 kvinder døde af denne sygdom1. Selvom der er gjort tilstrækkelige fremskridt inden for kirurgi og kemoterapi, udvikler over 70% af patienterne med avanceret sygdom kemoterapeutisk resistens og dør inden for 5 år efter diagnose 2,3. Derfor er der et presserende behov for nye strategier til behandling af denne dødelige sygdom og repræsentative, pålidelige modeller for præklinisk forskning.
Kræftcellelinjer og patientafledte xenotransplantater (PDX) skabt a....
Alle humane vævsprøver indsamlet til forskning blev opnået i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkendt protokol. De protokoller, der er skitseret nedenfor, blev udført i et sterilt humant vævskulturmiljø. Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra mennesker. Egnede patienter skulle have en diagnose eller formodet diagnose af kræft i æggestokkene, være villige og i stand til at underskrive informeret samtykke og være mindst 18 år. Tumorvæv (ondartet primær tumor eller metastatiske sted.......
For at generere BDO'er blev prøverne fordøjet mekanisk og enzymatisk i enkeltcellesuspensioner. Cellerne blev derefter resuspenderet i BME og suppleret med specifikt konstruerede medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dage, hvorefter de demonstrerer diskrete organoider i kultur (figur 4).
Kræft i æggestokkene er ekstremt dødelig på grund af dets avancerede stadium ved diagnosen samt den almindelige udvikling af kemoterapiresistens. Mange fremskridt inden for forskning i kræft i æggestokkene er blevet gjort ved at udnytte kræftcellelinjer og PDX-modeller; Der er imidlertid et indlysende behov for en mere repræsentativ og økonomisk overkommelig in vitro-model . BDO'er har vist sig nøjagtigt at repræsentere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske træk.......
Vi er taknemmelige for vejledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjælp fra Barbara Blachut, MD, til at etablere denne protokol. Vi vil også gerne anerkende Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette projekt.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved