Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.
Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB's een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.
In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.
Kankercellijnen en patiënt-afgeleide....
Alle menselijke weefselmonsters die voor onderzoek zijn verzameld, zijn verkregen volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol. De onderstaande protocollen werden uitgevoerd in een steriele menselijke weefselkweekomgeving. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van menselijke proefpersonen. In aanmerking komende patiënten moesten een diagnose of vermoedelijke diagnose van eierstokkanker hebben, bereid en in staat zijn om geïnformeerde toestemming te ondertekenen en ten min.......
Om BOB's te genereren, werden de monsters mechanisch en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in BME en aangevuld met specifiek ontworpen media (figuur 3). Organoïden worden meestal vastgesteld over een tijdsbestek van 10 dagen, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertonen (figuur 4).
Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB's hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren n.......
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved