Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont une culture tridimensionnelle (3D) qui peut imiter l’environnement tumoral in vitro. Dans le cancer séreux de l’ovaire de haut grade, les AOP représentent un modèle pour étudier de nouveaux biomarqueurs et thérapeutiques.
Les organoïdes sont des modèles tumoraux dynamiques 3D qui peuvent être cultivés avec succès à partir de tissus tumoraux ovariens dérivés de patients, d’ascites ou de liquide pleural et aident à la découverte de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs du cancer de l’ovaire. Ces modèles récapitulent l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. De plus, il a été démontré qu’ils correspondent à la tumeur primaire morphologiquement, cytologiquement, immunohistochimiquement et génétiquement. Ainsi, les organoïdes facilitent la recherche sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et sont supérieurs aux lignées cellulaires. Le présent protocole décrit des méthodes distinctes pour générer des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes à partir de tumeurs de patientes, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les échantillons de patients sont séparés en suspensions cellulaires par digestion mécanique et enzymatique. Les cellules sont ensuite plaquées à l’aide d’un extrait de membrane basale (EMB) et sont soutenues par des milieux de croissance optimisés contenant des suppléments spécifiques à la culture du cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC). Après avoir formé les organoïdes initiaux, les AOP peuvent soutenir la culture à long terme, y compris le passage pour l’expansion pour des expériences ultérieures.
En 2021, environ 21 410 femmes aux États-Unis ont reçu un diagnostic de cancer épithélial de l’ovaire et 12 940 femmes sont décédées de cette maladie1. Bien que des progrès suffisants aient été réalisés en chirurgie et en chimiothérapie, plus de 70% des patients atteints d’une maladie avancée développent une résistance chimiothérapeutique et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic 2,3. Ainsi, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie mortelle et des modèles représentatifs et fiables pour la recherche préclinique sont nécessaires de toute urgence.
Tous les échantillons de tissus humains prélevés pour la recherche ont été obtenus conformément au protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel (CISR). Les protocoles décrits ci-dessous ont été exécutés dans un environnement stérile de culture de tissus humains. Le consentement écrit éclairé a été obtenu de sujets humains. Les patientes admissibles devaient avoir un diagnostic ou un diagnostic présumé de cancer de l’ovaire, être disposées et capables de signer un consentement éclai.......
Pour générer des AOP, les échantillons ont été digérés mécaniquement et enzymatiquement en suspensions unicellulaires. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans des BME et complétées par des milieux spécialement conçus (Figure 3). Les organoïdes sont généralement établis sur une période de 10 jours, après quoi ils démontrent des organoïdes discrets en culture (Figure 4).
Le cancer de l’ovaire est extrêmement mortel en raison de son stade avancé au moment du diagnostic, ainsi que du développement courant de la résistance à la chimiothérapie. De nombreux progrès dans la recherche sur le cancer de l’ovaire ont été réalisés en utilisant des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX; Cependant, il existe un besoin évident d’un modèle in vitro plus représentatif et abordable. Les AOP se sont avérées représenter avec précision l’hétérogénéité .......
Nous sommes reconnaissants des conseils de Ron Bose, MD, PhD, et de l’aide de Barbara Blachut, MD, dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved