Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.

Organoide sind dynamische 3D-Tumormodelle, die erfolgreich aus patientischem Ovarialtumorgewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit gezüchtet werden können und bei der Entdeckung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker für Eierstockkrebs helfen. Diese Modelle rekapitulieren die klonale Heterogenität, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sie morphologisch, zytologisch, immunhistochemisch und genetisch mit dem Primärtumor übereinstimmen. So erleichtern Organoide die Erforschung von Tumorzellen und der Tumormikroumgebung und sind Zelllinien überlegen. Das vorliegende Protokoll beschreibt verschiedene Methoden zur Erzeugung von von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden aus Patiententumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die Patientenproben werden sowohl durch mechanischen als auch durch enzymatischen Aufschluss in zelluläre Suspensionen getrennt. Die Zellen werden dann mit einem Basalmembranextrakt (BME) plattiert und mit optimierten Wachstumsmedien unterstützt, die Nahrungsergänzungsmittel enthalten, die spezifisch für die Kultivierung von hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC) sind. Nach der Bildung der ersten Organoide können die PDOs eine Langzeitkultur aufrechterhalten, einschließlich der Passage zur Expansion für nachfolgende Experimente.

Im Jahr 2021 wurde bei etwa 21.410 Frauen in den Vereinigten Staaten neu epithelialer Eierstockkrebs diagnostiziert, und 12.940 Frauen starben an dieser Krankheit¹. Obwohl in der Chirurgie und Chemotherapie ausreichende Fortschritte erzielt wurden, entwickeln über 70% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eine chemotherapeutische Resistenz und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose ^2,3. Neue Strategien zur Behandlung dieser tödlichen Krankheit und repräsentative, verlässliche Modelle für die präklinische Forschung sind daher dringend erforderlich.

Alle menschlichen Gewebeproben, die für Forschungszwecke gesammelt wurden, wurden gemäß dem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gewonnen. Die unten beschriebenen Protokolle wurden in einer sterilen menschlichen Gewebekulturumgebung durchgeführt. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von menschlichen Probanden eingeholt. Geeignete Patienten mussten eine Diagnose oder vermutete Diagnose von Eierstockkrebs haben, bereit und in der Lage sein, eine Einverständniserklärung zu unterschrei.......

Um PDOs zu erzeugen, wurden die Proben mechanisch und enzymatisch zu Einzelzellsuspensionen aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann in BME resuspendiert und mit speziell hergestellten Medien ergänzt (Abbildung 3). Organoide werden in der Regel über einen Zeitraum von 10 Tagen etabliert, danach zeigen sie diskrete Organoide in Kultur (Abbildung 4).

Eierstockkrebs ist aufgrund seines fortgeschrittenen Stadiums bei der Diagnose sowie der häufigen Entwicklung einer Chemotherapieresistenz extrem tödlich. Viele Fortschritte in der Eierstockkrebsforschung wurden durch die Verwendung von Krebszelllinien und PDX-Modellen erzielt. Es besteht jedoch ein offensichtlicher Bedarf an einem repräsentativeren und erschwinglicheren In-vitro-Modell . PDOs repräsentieren nachweislich die Tumorheterogenität, die Tumormikroumgebung sowie die genomischen und transkriptomis.......

Wir sind dankbar für die Anleitung von Ron Bose, MD, PhD, und die Unterstützung von Barbara Blachut, MD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University und dem Reproductive Scientist Development Program für die Unterstützung dieses Projekts bedanken.