Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.
אורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים דינמיים שניתן לגדל בהצלחה מרקמת גידול שחלה שמקורה במטופלת, מיימת או נוזל פלאורלי ולסייע בגילוי טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים לסרטן השחלות. מודלים אלה משחזרים הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), את המיקרו-סביבה של הגידול (tumor microenvironment) ואת האינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים. בנוסף, הם הוכחו כמתאימים לגידול הראשוני מבחינה מורפולוגית, ציטולוגית, אימונוהיסטוכימית וגנטית. לפיכך, אורגנואידים מאפשרים מחקר על תאי הגידול ועל המיקרו-סביבה של הגידול והם עדיפים על קווי תאים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות שונות ליצירת אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. דגימות המטופל מופרדות לתרחיפים תאיים על ידי עיכול מכני ואנזימטי כאחד. לאחר מכן התאים מצופים באמצעות תמצית קרום מרתף (BME) ונתמכים במצע גדילה אופטימלי המכיל תוספים ספציפיים לגידול סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC). לאחר יצירת אורגנואידים ראשוניים, PDOs יכולים לקיים תרבית ארוכת טווח, כולל מעבר להרחבה לניסויים הבאים.
בשנת 2021, כ-21,410 נשים בארה"ב אובחנו לאחרונה עם סרטן שחלות אפיתל, ו-12,940 נשים נפטרו ממחלה זו1. למרות התקדמות מספקת נעשו בניתוחים וכימותרפיה, מעל 70% מהחולים עם מחלה מתקדמת לפתח עמידות כימותרפית למות בתוך 5 שנים של אבחנה 2,3. לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות חדשות לטיפול במחלה קטלנית זו ובמודלים מייצגים ואמינים למחקר פרה-קליני.
קווי תאים סרטניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופלות (PDX) שנוצרו מגידולים ראשוניים בשחלות הם המכשירים העיקריים המשמשים במחקר סרטן השחלות. יתרון מרכזי של קווי תאים סרטניים הוא ההתרחבות המהירה שלהם. עם זאת, התרבית המתמשכת שלהם גורמת לשינויים ....
כל דגימות הרקמה האנושית שנאספו למחקר התקבלו על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). הפרוטוקולים המתוארים להלן בוצעו בסביבת תרבית רקמה אנושית סטרילית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנבדקים אנושיים. מטופלות זכאיות היו צריכות לקבל אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן השחלות, להיות מוכנות ו?.......
כדי ליצור PDOs, הדגימות עוכלו באופן מכני ואנזימטי לתרחיפים חד-תאיים. התאים הושעו מחדש ב-BME ונוספו להם מדיה מהונדסת במיוחד (איור 3). אורגנואידים נוצרים בדרך כלל על פני מסגרת זמן של 10 ימים, שלאחריה הם מדגימים אורגנואידים נפרדים בתרבית (איור 4).
סרטן השחלות קטלני ביותר בשל השלב המתקדם שלו באבחון, כמו גם ההתפתחות הנפוצה של עמידות לכימותרפיה. התקדמות רבה במחקר סרטן השחלות נעשתה על ידי שימוש בקווי תאים סרטניים ומודלים PDX; עם זאת, יש צורך ברור במודל ייצוגי יותר ובמחיר סביר יותר במבחנה . PDOs הוכיחו שהם מייצגים במדויק את ההטרוגניות ש?.......
אנו אסירי תודה על הדרכתו של רון בוס, MD, PhD, ועל עזרתה של ברברה בלאחוט, MD, בביסוס פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved