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Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양
환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.
오가노이드는 환자 유래 난소 종양 조직, 복수 또는 흉수에서 성공적으로 성장할 수 있는 3D 동적 종양 모델이며 난소암에 대한 새로운 치료법 및 예측 바이오마커의 발견을 돕습니다. 이 모델은 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 요약합니다. 또한, 그들은 형태학적으로, 세포학적으로, 면역조직화학적으로, 유전적으로 원발성 종양과 일치하는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드는 종양 세포 및 종양 미세 환경에 대한 연구를 용이하게 하며 세포주보다 우수합니다. 현재 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 종양, 복수 및 흉막액 샘플에서 환자 유래 난소암 오가노이드를 생성하는 고유한 방법을 설명합니다. 환자 샘플은 기계적 및 효소 분해에 의해 세포 현탁액으로 분리됩니다. 그런 다음 기저막 추출물(BME)을 사용하여 세포를 도말하고 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 배양에 특이적인 보충제를 포함하는 최적화된 성장 배지로 지지합니다. 초기 오가노이드를 형성한 후 PDO는 후속 실험을 위한 확장을 위한 계대배양을 포함하여 장기간 배양을 지속할 수 있습니다.
2021년에 미국에서 약 21,410명의 여성이 상피성 난소암 진단을 받았고 12,940명의 여성이 이 질병으로 사망했습니다1. 수술과 화학요법이 충분히 발전했음에도 불구하고, 진행성 질환 환자의 70% 이상이 화학요법 내성이 나타나 진단 후 5년 이내에 사망한다 2,3. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 전략과 전임상 연구를 위한 대표적이고 신뢰할 수 있는 모델이 시급히 필요합니다.
원발성 난소 종양에서 생성된 암 세포주와 환자 유래 이종이식(PDX)은 난소암 연구에 사용되는 주요 도구입니다. 암 세포주의 주요 장점은 빠른 확장입니다. 그러나 이들의 지속적인 배양은 암 세포주가 원래의 원발성 암 종양 샘플에서 벗어나게 하는 표현형 및 유전형 변화를 초래합니다. 암 세포주와 원발성 종양 사이의 기존 차이로 인해, 세포주에서 긍정적인 영향을 미치는 약물 분석은 임상 시험에서 동일한 효과를 나타내지 못한다2. 이러한 한계를 극복하기 위해 PDX 모델이 사용됩니다. 이 모델은 신선한 난소암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 만들어집니다.
연구를 위해 수집된 모든 인체 조직 표본은 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 아래에 요약된 프로토콜은 멸균 인체 조직 배양 환경에서 수행되었습니다. 정보에 입각한 서면 동의는 인간 피험자로부터 얻었습니다. 적격 환자는 난소암 진단 또는 추정 진단을 받았고, 정보에 입각한 동의서에 서명할 의지와 능력이 있어야 하며, 18세 이상이어야 했습니다. 종양 조직(악.......
난소암은 진단 시 진행 단계와 화학 요법 내성의 일반적인 발달로 인해 매우 치명적입니다. 난소암 연구의 많은 발전은 암 세포주와 PDX 모델을 활용하여 이루어졌습니다. 그러나 보다 대표적이고 저렴한 시험관 내 모델에 대한 분명한 필요성이 있습니다. PDO는 원발성 종양의 종양 이질성, 종양 미세환경, 게놈 및 전사체적 특징을 정확하게 나타내는 것으로 입증되었으며, 따라서 약물 요법?.......
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
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