Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Pasientavledede organoider (PUD) er en tredimensjonal (3D) kultur som kan etterligne tumormiljøet in vitro. I høygradig serøs eggstokkreft representerer PUD en modell for å studere nye biomarkører og terapi.
Organoider er 3D-dynamiske tumormodeller som kan dyrkes vellykket fra pasientavledet ovarietumorvev, ascites eller pleuravæske og hjelpe til med oppdagelsen av nye terapier og prediktive biomarkører for eggstokkreft. Disse modellene rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. I tillegg har de vist seg å matche den primære svulsten morfologisk, cytologisk, immunhistokjemisk og genetisk. Dermed letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er overlegne cellelinjer. Denne protokollen beskriver forskjellige metoder for å generere pasientavledede eggstokkreftorganoider fra pasienttumorer, ascites og pleuravæskeprøver med en høyere enn 97% suksessrate. Pasientprøvene separeres i cellulære suspensjoner ved både mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Cellene blir deretter belagt ved hjelp av et kjellermembranekstrakt (BME) og støttes med optimaliserte vekstmedier som inneholder kosttilskudd som er spesifikke for dyrking av høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC). Etter å ha dannet innledende organoider, kan PUDene opprettholde langsiktig kultur, inkludert passasje for utvidelse for påfølgende eksperimenter.
I 2021 ble omtrent 21,410 kvinner i USA nylig diagnostisert med epitelial eggstokkreft, og 12,940 kvinner døde av denne sykdommen1. Selv om det er gjort tilstrekkelige fremskritt innen kirurgi og kjemoterapi, utvikler over 70% av pasientene med avansert sykdom kjemoterapeutisk resistens og dør innen 5 år etter diagnose 2,3. Dermed er det behov for nye strategier for å behandle denne dødelige sykdommen og representative, pålitelige modeller for preklinisk forskning.
Kreftcellelinjer og pasientavledede xenotransplantater (PDX) opprettet fra primære eggstokktumo....
Alle humane vevsprøver samlet for forskning ble oppnådd i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoll. Protokollene som er skissert nedenfor ble utført i et sterilt humant vevskulturmiljø. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra mennesker. Kvalifiserte pasienter måtte ha en diagnose eller antatt diagnose av eggstokkreft, være villige og i stand til å signere informert samtykke, og være minst 18 år. Tumorvev (malign primærtumor eller metastaserende steder), ascites og pleuravæske ble.......
For å generere PUD ble prøvene fordøyd mekanisk og enzymatisk til encellede suspensjoner. Cellene ble deretter resuspendert i BME og supplert med spesifikt konstruerte medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dager, hvoretter de påviser diskrete organoider i kultur (figur 4).
Eggstokkreft er ekstremt dødelig på grunn av sitt avanserte stadium ved diagnose, samt den vanlige utviklingen av kjemoterapiresistens. Mange fremskritt innen eggstokkreftforskning har blitt gjort ved å bruke kreftcellelinjer og PDX-modeller; Det er imidlertid et åpenbart behov for en mer representativ og rimelig in vitro-modell . PUD har vist seg å nøyaktig representere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske egenskapene til deres primære svulster, og er dermed ideell.......
Vi er takknemlige for veiledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjelpen fra Barbara Blachut, MD, i etableringen av denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne Washington University's School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved