Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Os organoides derivados do paciente (DOP) são uma cultura tridimensional (3D) que pode imitar o ambiente tumoral in vitro. No câncer de ovário seroso de alto grau, as DOPs representam um modelo para estudar novos biomarcadores e terapias.

Os organoides são modelos de tumores dinâmicos 3D que podem ser cultivados com sucesso a partir de tecido tumoral de ovário derivado do paciente, ascite ou líquido pleural e ajudam na descoberta de novas terapêuticas e biomarcadores preditivos para o câncer de ovário. Esses modelos recapitulam a heterogeneidade clonal, o microambiente tumoral e as interações célula-célula e célula-matriz. Além disso, eles demonstraram corresponder ao tumor primário morfologicamente, citologicamente, imuno-histoquimicamente e geneticamente. Assim, os organoides facilitam a pesquisa sobre as células tumorais e o microambiente tumoral e são superiores às linhagens celulares. O presente protocolo descreve métodos distintos para gerar organoides de câncer de ovário derivados de pacientes a partir de tumores, ascite e amostras de líquido pleural com uma taxa de sucesso superior a 97%. As amostras do paciente são separadas em suspensões celulares por digestão mecânica e enzimática. As células são então banhadas utilizando um extrato de membrana basal (BME) e são suportadas com meios de crescimento otimizados contendo suplementos específicos para a cultura de câncer de ovário seroso de alto grau (HGSOC). Depois de formar organoides iniciais, as DOP podem sustentar a cultura a longo prazo, incluindo a passagem para expansão para experimentos subsequentes.

Em 2021, aproximadamente 21.410 mulheres nos Estados Unidos foram recém-diagnosticadas com câncer de ovário epitelial, e 12.940 mulheres morreram dessa doença¹. Embora avanços suficientes tenham sido feitos na cirurgia e na quimioterapia, mais de 70% dos pacientes com doença avançada desenvolvem resistência quimioterápica e morrem dentro de 5 anos após o diagnóstico ^2,3. Assim, novas estratégias para tratar esta doença mortal e modelos representativos e confiáveis para a pesquisa pré-clínica são urgentemente necessários.

Linhagens celulares de câncer e xenoen....

Todos os espécimes de tecido humano coletados para pesquisa foram obtidos de acordo com o protocolo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB). Os protocolos descritos abaixo foram realizados em um ambiente estéril de cultura de tecidos humanos. O termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido de seres humanos. As pacientes elegíveis tinham que ter um diagnóstico ou diagnóstico presumido de câncer de ovário, estar dispostas e capazes de assinar o consentimento informado e ter pelo menos 18 anos de idade.......

Para gerar DOPs, as amostras foram digeridas mecanicamente e enzimaticamente em suspensões unicelulares. As células foram então ressuspensas em BME e suplementadas com meios especificamente modificados (Figura 3). Os organoides são tipicamente estabelecidos ao longo de um período de tempo de 10 dias, após o qual demonstram organoides discretos em cultura (Figura 4).

O câncer de ovário é extremamente mortal devido ao seu estágio avançado no diagnóstico, bem como ao desenvolvimento comum de resistência à quimioterapia. Muitos avanços na pesquisa do câncer de ovário foram feitos utilizando linhas celulares de câncer e modelos PDX; no entanto, há uma necessidade evidente de um modelo in vitro mais representativo e acessível. As DOP têm demonstrado representar com precisão a heterogeneidade tumoral, o microambiente tumoral e as características genômicas e trans.......

Somos gratos pela orientação de Ron Bose, MD, PhD, e pela assistência de Barbara Blachut, MD, no estabelecimento deste protocolo. Também gostaríamos de agradecer à Escola de Medicina da Universidade de Washington no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia e Divisão de Oncologia Ginecológica da Universidade de Washington, ao Programa Acadêmico do Decano da Universidade de Washington e ao Programa de Desenvolvimento de Cientistas Reprodutivos por seu apoio a este projeto.