Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Cancer Research
Органоиды, полученные от пациента (PDO), представляют собой трехмерную (3D) культуру, которая может имитировать опухолевую среду in vitro. При серозном раке яичников высокой степени злокачественности PDO представляют собой модель для изучения новых биомаркеров и терапевтических средств.
Органоиды представляют собой 3D-динамические модели опухолей, которые могут быть успешно выращены из ткани опухоли яичников, асцита или плевральной жидкости пациента и помогают в открытии новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров рака яичников. Эти модели повторяют клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клетками и матриксом. Кроме того, было показано, что они соответствуют первичной опухоли морфологически, цитологически, иммуногистохимически и генетически. Таким образом, органоиды облегчают исследования опухолевых клеток и микроокружения опухоли и превосходят клеточные линии. Настоящий протокол описывает различные способы получения органоидов рака яичников пациента из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости пациента с вероятностью успеха более 97%. Образцы пациентов разделяются на клеточные суспензии путем механического и ферментативного сбраживания. Затем клетки покрываются с использованием экстракта базальной мембраны (BME) и поддерживаются оптимизированными питательными средами, содержащими добавки, специфичные для культивирования серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). После формирования исходных органоидов PDO могут поддерживать долгосрочную культуру, включая передачу для расширения для последующих экспериментов.
В 2021 году примерно у 21 410 женщин в Соединенных Штатах был впервые диагностирован эпителиальный рак яичников, и 12 940 женщин умерли от этого заболевания1. Несмотря на то, что в хирургии и химиотерапии были достигнуты достаточные успехи, более 70% пациентов с прогрессирующим заболеванием развивают химиотерапевтическую резистентность и умирают в течение 5 лет после постановки диагноза 2,3. Таким образом, срочно необходимы новые стратегии лечения этого смертельного заболевания и репрезентативные, надежные модели для доклинических исследований.
Линии раковых ....
Все образцы тканей человека, собранные для исследования, были получены в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протоколы, изложенные ниже, были выполнены в стерильной среде культивирования тканей человека. Информированное письменное сог?.......
Для получения PDO образцы механически и ферментативно расщепляли в одноклеточные суспензии. Затем клетки ресуспендировали в BME и дополняли специально сконструированными средами (рис. 3). Органоиды обычно устанавливаются в течение 10 дней, после чего они демонстрируют дис?.......
Рак яичников чрезвычайно смертелен из-за его поздней стадии при постановке диагноза, а также из-за общего развития резистентности к химиотерапии. Многие успехи в исследованиях рака яичников были достигнуты за счет использования линий раковых клеток и моделей PDX; Тем не менее, существуе.......
Мы благодарны за руководство Рону Бозе, доктору медицины, доктору философии, и за помощь Барбары Блахут, доктора медицины, в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета в Сент-Луисе, кафедру акушерства и гинекологии и отделение гинекологической онкологии, Программу стипендий декана Вашингтонского университета и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
10 mL Serological Pipet | |||
100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
37 °C water bath | NEST | 602052 | |
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
Agar | Lamda Biotech | C121 | |
B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
Centrifuge | |||
Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
Microcentrifuge | |||
Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
p1000 Pipette with Tips | |||
p200 Pipette with Tips | |||
Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
Pipet Controller | |||
Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
Tissue Culture Hood | |||
Tissue Embedding Cassette | |||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
Vortex |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved